oxLDL干擾HUVECs的DSG1和DSC2表達并增加單層內(nèi)皮細胞對LDL的通透性.pdf

1、研究背景：關于動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生,目前普遍認為與血漿中脂蛋白水平的升高，血管內(nèi)皮細胞的損傷導致的動脈壁通透性增加以及脂蛋白穿過內(nèi)皮屏障在內(nèi)皮下沉積等有關。在動脈粥樣硬化（AS）斑塊和泡沫細胞中檢測到了氧化修飾的低密度脂蛋白（oxLDL），提示oxLDL與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關。但迄今為止未見oxLDL促進內(nèi)皮細胞對LDL通透性機制方面的報道。橋粒芯糖蛋白-1(DSG1)和橋粒芯膠蛋白-2(DSC2)屬于橋粒鈣粘素蛋白家族成員，存

2、在于血管內(nèi)皮細胞間隙，發(fā)揮了血管壁與血液間的物理屏障作用，維持細胞與細胞之間的完整性。因此內(nèi)皮細胞與細胞間的這種橋粒連接在通透性調(diào)控方面起了重要的作用。本研究意在探討xLDL對內(nèi)皮細胞DSG1和DSC2表達的影響，以及由此導致對內(nèi)皮細胞通透性的影響。
　　實驗一，oxLDL對HUVEC細胞DSG1，DSC2表達的影響
　　目的：觀察oxLDL對人臍靜脈內(nèi)皮細胞上跨膜蛋白DSG1和DSC2表達的影響，以及人臍靜脈內(nèi)皮細胞受到這

3、種氧化型脂蛋白刺激后對單層細胞通透性的變化。
　　方法：每次實驗前24小時，給HUVECs換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)后加處理因素。不同濃度oxLDL（0 mg/L，10 mg/L，25 mg/L，50 mg/L）處理HUVEC24h，檢測細胞 DSG1，DSC2 mRNA和蛋白的表達，再用50mg/L oxLDL分別處理HUVEC不同時間（0h，6h，12h，24h），用Western blotting和RT-PCR分別檢測細胞DSG1，D

4、SC2 mRNA和蛋白的表達。
　　結(jié)果：HUVECs上有DSG1、DSC2 mRNA與蛋白質(zhì)的表達；oxLDL使DSG1、DSC2 mRNA與蛋白的表達下調(diào)，且成時間與劑量依賴關系（P<0.05）。
　　實驗二，oxLDL對HUVECs單層通透性的影響
　　目的：觀察oxLDL對人臍靜脈內(nèi)皮細胞單層通透性的影響。
　　方法：用不同濃度的oxLDL（0 mg/L，10 mg/L，25 mg/L，50 mg/L）分

5、別或者與SOD共同孵育HUVECs24h，空白組作為對照，通過Transwell系統(tǒng)檢測單層細胞對BSA和LDL的通透性情況，采用熒光分光光度法測定FITC-BSA和FITC-LDL的含量。
　　結(jié)果：oxLDL能顯著增加HUVECs單層對BSA和LDL的通透性，且作用隨著濃度增加而增強，在50mg/L時有顯著作用（P<0.05）；SOD能使50mg/L oxLDL誘導的HUVECs單層通透性降低（P<0.05）。
　　實驗

6、三，ROS參與oxLDL對HUVEC DSG1和DSC2表達的調(diào)節(jié)
　　目的：探討oxLDL是否通過促進細胞內(nèi)ROS生成參與調(diào)節(jié)HUVEC細胞DSG1和DSC2的表達。
　　方法：用 LDL(50mg/L)、oxLDL(50mg/L)、BSA(100mg/L)、H2O2(5mg/L)分別與HUVECs孵育24h，空白組作為對照，用RT-PCR與Western blotting分別檢測 HUVECs DSG1、DSC2 mRN

7、A與蛋白質(zhì)的表達水平。用50mg/L的oxLDL、50mg/LSOD預處理再加oxLDL、50mg/LSOD分別與 HUVECs孵育24h，用DCFH-DA染色法檢測細胞內(nèi)活性氧的生成情況；用RT-PCR與Western blotting分別檢測HUVECs DSG1、DSC2 mRNA與蛋白質(zhì)的表達水平；用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞DSG1的免疫反應性。
　　結(jié)果：oxLDL、H2O2使 HUVECs DSG1、DSC2 mRNA