miR-124在乳腺癌骨轉移中的作用及機制研究.pdf

1、[研究背景及目的]
　　乳腺癌是我國女性中最常見的惡性腫瘤。盡管隨著診斷和治療水平的發(fā)展，早期乳腺癌更容易得到診斷，并已有標準的治療選擇，生存率也有所提高。然而，晚期乳腺癌患者常發(fā)生局部進展或遠處轉移，目前仍無公認的治療標準，生存期亦未得到顯著改善。乳腺癌遠處轉移最常見的部位是骨。骨轉移可引起骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫等骨相關事件(SREs)，嚴重影響患者的生存質量和總體預后。
　　目前，除了化療、內分泌治療和分子靶向治療等

2、全身治療以及手術治療和放療等局部治療以外，骨調節(jié)藥物(bone modifying agents)因可發(fā)揮預防和治療骨轉移相關事件的作用，已在乳腺癌骨轉移患者的治療中占據(jù)重要地位。然而，骨調節(jié)藥物并不能預防乳腺癌患者發(fā)生骨轉移，亦沒有證據(jù)證實其可延長患者生存時間。因此，深入研究發(fā)生乳腺癌骨轉移的機制，尋找新的治療靶點，將有助于進一步改善患者的生存質量，延長生存期。
　　乳腺癌骨轉移過程中，腫瘤細胞經(jīng)過遷移、侵襲、粘附等環(huán)節(jié)到達骨微

3、環(huán)境后，和骨微環(huán)境中的成骨細胞、破骨細胞、骨基質細胞之間產(chǎn)生復雜的相互作用，導致成骨/破骨平衡打破，形成了主要表現(xiàn)為溶骨性病變的病灶，引發(fā)骨相關事件。在以上過程中，許多發(fā)揮調控作用的基因或分子表達出現(xiàn)異常，可能成為新的作用靶點或診斷標志物，微小RNA（microRNA，miRNA）就是其中的研究熱點之一。作為基因轉錄后調控的重要元件之一，miRNA可通過作用于與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關的信號轉導通路或骨微環(huán)境中的重要細胞因子或趨化因子促進或抑

4、制乳腺癌骨轉移的發(fā)生。作為內源存在的非編碼雙鏈RNA，miRNA具有一定的組織特異性和分子靶向性，通過外源性調控相關miRNA表達可能比傳統(tǒng)的放化療更安全，可能成為治療乳腺癌骨轉移的新手段，具有良好的應用前景。
　　miR-124最早在小鼠腦組織中被克隆，隨后被證實在人胚胎干細胞中亦有表達。作為腦組織中表達量最高的miRNA之一，已有許多研究表明miR-124主要參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，其表達異常與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關。近來有越來越

5、多的研究關注miR-124在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。有研究表明miR-124在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠質瘤、白血病等多種惡性腫瘤中表達異常，并通過靶向作用于多個癌基因發(fā)揮抑制腫瘤惡性生物學行為的作用。其中有數(shù)個研究證實miR-124可抑制乳腺癌的增殖、遷移和侵襲，提示其在乳腺癌轉移過程中發(fā)揮重要作用。但目前為止，關于miR-124在乳腺癌骨轉移中的作用尚未見報道。因此，本課題旨在明確miR-124在

6、乳腺癌骨轉移發(fā)生中的作用，并初步探討其作用機制，為乳腺癌骨轉移的治療提供新的靶點。
　　[實驗方法]
　　一、miR-124在不同骨轉移能力乳腺癌細胞及小鼠乳腺癌骨轉移組織中的表達
　　1、比較正常乳腺組織和不同轉移能力乳腺癌細胞中miR-124表達：分離正常小鼠乳腺組織，抽取RNA。培養(yǎng)不同骨轉移能力的乳腺癌細胞株BT549、 MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、

7、T47D、BT474,抽取細胞總RNA。Real-time PCR法檢測以上組織和細胞中miR-124的表達情況。
　　2、檢測并比較母代乳腺癌細胞和小鼠乳腺癌骨轉移組織中miR-124表達：小鼠左心室注射熒光素酶標記的MDA-MB-231制備乳腺癌骨轉移模型?；铙w成像儀監(jiān)測小鼠在體熒光信號。待發(fā)生骨轉移后處死小鼠，留取骨轉移組織，抽取RNA。Real-time PCR法檢測以上組織和母代MDA-MB-231細胞中miR-124的

8、表達情況。
　　3、檢測人乳腺癌骨轉移組織中miR-124表達，分析其與患者無轉移生存期關系
　　收集5例乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉移組織標本，原位雜交法檢測miR-124表達，比較各組表達差異。收集20例人乳腺癌骨轉移標本，抽取總RNA，Real-time PCR法檢測miR-124的表達情況。通過隨訪了解患者從發(fā)現(xiàn)原發(fā)癌到發(fā)現(xiàn)骨轉移灶的時間，即無骨轉移生存期（Bone metastasis free survi

9、val），分析miR-124表達與患者無骨轉移生存期的相關性。
　　二、體外調控乳腺癌細胞miR-124表達對成骨細胞和破骨細胞的作用
　　1、上調乳腺癌細胞miR-124表達或抑制其作用對骨髓來源的巨噬細胞分化為破骨細胞的影響：乳腺癌細胞MDA-MB-231轉染化學合成的miR-124擬似物(miR-124mimic)及陰性對照（NC）或miR-124競爭性抑制物(miR-124 inhibitor)及陰性對照（inhib

10、itor NC），收取轉染后48小時培養(yǎng)上清。從小鼠股骨分離骨髓來源巨噬細胞（BMM）作為破骨細胞前體細胞，利用上述各組腫瘤細胞的培養(yǎng)上清培養(yǎng)BMM細胞，6天后進行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色明確破骨細胞分化情況。
　　2、改變乳腺癌細胞miR-124表達對成骨細胞RANKL和OPG表達影響：MDA-MB-231細胞轉染miR-124 mimic及NC或miR-124 inhibitor及inhibitorNC，轉染后48小

11、時收取上清。利用各組上清分別培養(yǎng)成骨細胞前體細胞株3T3E1細胞，6天后提取不同上清培養(yǎng)組3T3E1細胞的RNA，Real-time PCR法檢測其中RANKL和OPG表達。
　　3、上調乳腺癌細胞miR-124表達對成骨細胞和破骨細胞相互作用的影響：MDA-MB-231細胞轉染miR-124 mimic及NC。上述各組乳腺癌細胞分別和3T3E1細胞共培養(yǎng)，3天后收集各組培養(yǎng)上清，利用該上清培養(yǎng)破骨細胞前體細胞株RAW264.7，

12、培養(yǎng)3天后提取各組細胞的RNA，Real-time PCR法檢測其中與破骨細胞分化相關的指標TRAP、c-Src、NFATc1和c-fos表達。
　　三、初步探討miR-124在乳腺癌骨轉移中的作用機制
　　1、利用軟件預測并篩選miR-124與骨轉移相關的靶基因：利用TargetScan軟件預測miR-124靶基因，并篩選其中與骨轉移相關的基因，發(fā)現(xiàn)白介素11（Interleukin11，IL11）為其潛在靶基因。

13、　　2、明確miR-124對IL11表達的影響：MDA-MB-231細胞轉染miR-124 mimic或inhibitor，Real-time PCR法檢測IL11mRNA表達，Western blot檢測其蛋白表達。
　　3、驗證miR-124與IL113'端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)的靶向結合作用：構建含有miR-124結合位點的IL113'-UTR熒光素酶報告基因質粒及該位點突變的

14、報告基因質粒，與miR-124 mimic或NC共轉染至HEK-293細胞，雙報告基因試劑盒檢測報告基因質粒熒光素酶活性，明確miR-124是否可通過結合IL113'-UTR靶向調控IL11的表達。
　　4、驗證IL11和miR-124在乳腺癌細胞及乳腺癌骨轉移組織中表達的相關性
　　(1)正常乳腺組織和不同轉移能力乳腺癌細胞中IL11和miR-124表達相關性：Real-time PCR法檢測正常小鼠乳腺組織和乳腺癌細胞株

15、BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474中IL11的表達情況，分析其與miR-124表達是否存在負相關。
　　(2)母代乳腺癌細胞和小鼠乳腺癌骨轉移組織中IL11和miR-124表達相關性：Real-time PCR法檢測MDA-MB-231細胞骨轉移模型小鼠標本和母代MDA-MB-231細胞中IL11的表達情況，分析其與miR-124表達的相關性。

16、
　　(3)人乳腺癌骨轉移組織中IL11和miR-124表達相關性：收集5例乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉移組織標本，免疫組化法檢測IL11表達，分析其與miR-124表達相關性。收集20例人乳腺癌骨轉移標本，抽取總RNA，Real-time PCR法檢測IL11的表達情況，分析其與miR-124表達的相關性。
　　四、統(tǒng)計學處理
　　若無特殊說明，實驗進行生物學重復3次，每次3個復孔。數(shù)據(jù)以(X)±SD，即均數(shù)

17、±標準差表示，用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計檢驗。方差齊性的兩組之間比較采用student t檢驗(Student's t test)，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗。相關性分析采用Pearson相關性分析。通過統(tǒng)計檢驗計算P值，P＜0.05為具有顯著性統(tǒng)計學差異。
　　[實驗結果]
　　一、miR-124在高轉移性乳腺癌細胞及小鼠乳腺癌骨轉移組織中的表達下調
　　1、miR-124在乳腺癌細胞中表達下調，且在骨轉移能

18、力較高的乳腺癌細胞株中表達較低：Real-time PCR結果顯示，與正常小鼠乳腺組織相比，乳腺癌細胞中miR-124表達顯著下調，且其在骨轉移性較高的三陰（雌激素受體、孕激素受體和HER2均為陰性）乳腺癌細胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436中表達較骨轉移性低的細胞株MCF7、T47D、BT474低。
　　2、小鼠乳腺癌骨轉移組織中miR-124表達下調：小鼠左心室注射M

19、DA-MB-231細胞制備乳腺癌骨轉移模型。Real-time PCR結果顯示，與母代MDA-MB-231細胞相比，小鼠乳腺癌骨轉移組織中的miR-124表達量顯著下調。
　　3、人乳腺癌骨轉移組織中miR-124表達下調，且其表達與患者無骨轉移生存期相關：原位雜交法檢測乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉移組織標本miR-124表達，結果顯示與原發(fā)癌旁組織相比，人乳腺癌組織中miR-124表達明顯減少，在骨轉移標本中表達進一步減

20、少。檢測20例人乳腺癌骨轉移標本中miR-124表達并隨訪患者臨床過程后發(fā)現(xiàn)miR-124表達低者無骨轉移生存期較miR-124表達高者短。
　　二、體外調控乳腺癌細胞miR-124表達可直接或通過成骨細胞促進破骨細胞分化
　　1、上調乳腺癌細胞miR-124表達抑制BMM細胞分化為破骨細胞，抑制miR-124作用促進BMM細胞分化為破骨細胞：MDA-MB-231細胞轉染miR-124 mimic或NC后收集上清培養(yǎng)BMM細

21、胞，TRAP染色結果顯示miR-124 mimic組破骨細胞分化較對照組顯著減少。反之，MDA-MB-231細胞轉染miR-124 inhibitor或inhibitor NC后收集上清培養(yǎng)BMM細胞，TRAP染色結果顯示miR-124 inhibitor組破骨細胞分化較對照組顯著增加。
　　2、上調乳腺癌細胞miR-124表達增加成骨細胞OPG/RANKL比值，抑制miR-124作用降低成骨細胞OPG/RANKL比值：MDA-M

22、B-231細胞轉染miR-124 mimic或NC后收集上清培養(yǎng)3T3E1細胞，Real-time PCR結果顯示miR-124 mimic上清組3T3E1細胞中OPG與RANKL比值增加。反之，MDA-MB-231細胞轉染miR-124 inhibitor或inhibitor NC后收集上清培養(yǎng)3T3E1細胞，Real-time PCR結果顯示miR-124 inhibitor上清組3T3E1細胞中OPG與RANKL比值降低。

23、　　3、上調乳腺癌細胞miR-124表達抑制成骨細胞促進破骨細胞分化的能力：MDA-MB-231細胞轉染miR-124mimic或NC后分別和3T3E1細胞共培養(yǎng)，收上清培養(yǎng)RAW264.7細胞，Real-time PCR結果顯示miR-124mimic組上清培養(yǎng)的RAW264.7細胞中與破骨細胞分化相關的指標TRAP、c-Src、NFATc1和c-fos表達顯著下調。
　　三、miR-124部分通過調控IL11抑制乳腺癌骨轉移<

24、br>　　1、miR-124抑制IL11 mRNA和蛋白表達：MDA-MB-231細胞轉染miR-124 mimic或inhibitor，Real-time PCR結果顯示miR-124 mimic抑制IL11 mRNA表達，miR-124 inhibitor增加IL11 mRNA表達;Westem blot結果顯示miR-124 mimic抑制IL11蛋白表達，miR-124 inhibitor促進IL11蛋白表達。
　　2、m

25、iR-124靶向結合IL113'-UTR：構建IL113'-UTR熒光素酶報告基因質粒，與miR-124mimic或NC共轉染至293細胞，雙報告基因試劑盒檢測結果顯示miR-124 mimic可抑制該報告基因活性;將IL113'-UTR上miR-124結合位點突變，重復上述實驗，雙報告基因試劑盒檢測結果顯示位點突變后，miR-124 mimic對報告基因的作用消失。以上結果提示miR-124可通過結合IL113'-UTR靶向調控IL1

26、1的表達。
　　3、IL11和miR-124在乳腺癌細胞及乳腺癌骨轉移組織中表達呈顯著負相關
　　(1)正常乳腺組織和不同轉移能力乳腺癌細胞中IL11和miR-124表達呈負相關
　　Real-time PCR法檢測正常小鼠乳腺組織和乳腺癌細胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474中IL11的表達情況，相關性分析結果顯示IL11與mi

27、R-124表達呈顯著負相關。
　　(2)小鼠乳腺癌骨轉移組織中IL11和miR-124表達呈負相關
　　Real-time PCR法檢測MDA-MB-231細胞骨轉移模型小鼠標本和母代MDA-MB-231細胞中中IL11的表達情況，相關性分析結果顯示IL11與miR-124表達呈顯著負相關。
　　(3)人乳腺癌骨轉移組織中IL11和miR-124表達相關性
　　免疫組化法檢測乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉移

28、組織標本IL11表達，結果顯示與原發(fā)癌旁組織相比，人乳腺癌組織中IL11表達明顯增加，在骨轉移標本中表達進一步增加。收集20例人乳腺癌骨轉移標本， Real-time PCR及相關性分析結果顯示其中IL11的表達與miR-124表達呈顯著負相關。
　　[結論]
　　一、miR-124乳腺癌細胞和乳腺癌骨轉移標本中表達下調，并與患者無轉移生存期密切相關，提示其在乳腺癌骨轉移過程中發(fā)揮重要作用。
　　二、乳腺癌細胞中miR