RNAi介導的Lcy基因沉默對番茄果實中番茄紅素含量的影響.pdf

1、番茄紅素(Lycopene)是植物中的一種天然色素，屬于類胡蘿卜素中的一種，它是許多類胡蘿卜素生物合成的中間體，經(jīng)過環(huán)化可形成其它類胡蘿卜素。番茄紅素主要存在于番茄、西瓜、紅色葡萄柚等植物的果實，茶的葉片以及蘿卜、胡蘿卜等植物的根部，其中以番茄果實中的番茄紅素含量最高，其含量可達到3～14mg/100g。在成熟的番茄果實中，番茄紅素懸浮遍布于果肉中。番茄紅素是類胡蘿卜素中活性最強的抗氧化劑，有延遲衰老的作用，可以預防和緩解多種疾病，且對

2、人體沒有任何毒副作用，故被認定為營養(yǎng)型保健食品。番茄紅素在西方飲食中非常盛行，已被許多國家批準使用于食品、化裝品和藥品。因此，培育高番茄紅素的番茄品種，是近年來國內(nèi)外番茄品質(zhì)育種的熱點。番茄紅素在植物細胞中的合成是在質(zhì)體和葉綠體中進行的，其生物合成的過程為：八氫番茄紅素(Psy)在脫氫酶作用下依次脫氫生成六氫番茄紅素、鏈孢紅素和番茄紅素。番茄紅素在番茄紅素環(huán)化酶(Lcy)的作用下轉(zhuǎn)化為其它類胡蘿卜素。如果通過RNAi抑制番茄果實中番茄紅

3、素B環(huán)化酶基因的表達，就可以阻止番茄紅素降解，促進其積累，從而創(chuàng)造高番茄紅素的轉(zhuǎn)基因番茄新種質(zhì)。 本實驗從番茄基因組中分離了Pds啟動子片段，通過農(nóng)桿菌介導的方法將Pds-GUS基因?qū)敕阎?，研究Pds啟動子的表達特性；同時根據(jù)RNA聚合酶Ⅱ介導的RNA沉默(RdRP)原理，將番茄紅素β環(huán)化酶基因(Lcy-β)片段通過一段內(nèi)含子構(gòu)建成dsRNA基因，并用具有果實特異性表達的Pds啟動子調(diào)控該RNAi基因的表達，導入番茄后研究抑

4、制Lcy基因表達對番茄果實中番茄紅素含量的影響。該研究結(jié)果可為借助分子改良途徑提高番茄果實的番茄紅素含量奠定基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果包括以下幾個方面： 1．番茄Pds啟動子的克隆與功能分析根據(jù)GenBank中公布的番茄Pds啟動子序列(U46919)設(shè)計特異引物，從番茄基因組中分離了長1790bp的Pds啟動子序列，測序結(jié)果表明所分離的Pds啟動子序列和GenBank中公布的一致。通過Sal I和BamH I酶切將全長Pds

5、啟動子插入到pVCT-2020表達載體中，替換掉該載體中GUS基因的35S啟動子，構(gòu)建成攜有Pds GUS基因表達盒的植物基因表達載體。通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因方法將Pds-GUS基因轉(zhuǎn)入番茄中，獲得的轉(zhuǎn)基因番茄的果實、葉片及根經(jīng)X-Gluc染色5h，70％7,醇脫色后，顯微鏡下觀察照相。結(jié)果表明Pds啟動子具有果實特異性的特點。 2．番茄紅素環(huán)化酶(Lcy)基因的DNA片段的克隆，根據(jù)GenBank中公布的番茄紅素β環(huán)化酶基因(

6、Lcy-β)序列(X86452)設(shè)計特異引物，上游引物P166：CTATGGTGTTTGGGTGGATG，下游引物P167：GTGCTCGATGCAACTGGCTTCTCTA，通過PCR從番茄基因組中獲得了長302bp的Lcy片段，測序結(jié)果表明與GenBank公布的一致。 3．果實特異性RNAi的植物表達載體的構(gòu)建通過Sal I酶切，補平，再用BamHI酶切后連接，得到Lcy片段反向重復連接的中間克隆載體 pMD-srLcy。將

7、pMD-srLcy經(jīng)BamH I酶切，去磷酸化后與內(nèi)含子連接，構(gòu)建RNAi片段的中間克隆載體pMD-RNAi。pMD-RNAi經(jīng)Sal I和Ecl136 Ⅱ切下RNAi片段插入到pVCT2020載體中，構(gòu)建成pVCT-RNAi表達載體。pMD-Pds經(jīng)Sal I和EcoRI切下Pds啟動子后，將Pds片段插入到Sal I和EcoRI酶切的pVCT-RNAi載體中，構(gòu)建成pVCT-PdsRNAi載體。構(gòu)建成的pVCT-PdsRNAi表達載

8、體經(jīng)酶切鑒定，能獲得正確的目的帶，表明構(gòu)建的載體正確。 4．番茄遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立番茄種子經(jīng)肥皂水清洗2～3次，70％的乙醇消毒30s后，清水沖洗掉乙醇；然后在超凈臺上用10％的次氯酸鈉消毒30min，滅菌水漂洗4次后，接種于1/2MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2～3天，待番茄種子發(fā)芽后，于25℃，光照強度18001x，16h光/8h暗的光周期條件下培養(yǎng)直到子葉完全展開。切取番茄的子葉和下胚軸，分別接種到MS+1.0 mg/L 6-B

9、A+0.2 IBg/L IAA+3％蔗糖+6.5％瓊脂的固體培養(yǎng)基上，比較子葉和下胚軸的芽分化能力，結(jié)果表明子葉的芽分化能力高于下胚軸。 將番茄子葉接種到MS附加不同濃度6-BA(1～3 mg/L)與IAA(0.1～0.3 mg/L)及6-BA(1～3 mg/L)與NAA(0.1～0.3 mg/L)組合的培養(yǎng)基上，篩選適宜芽分化的激素濃度及最佳組合。結(jié)果表明在MS+1.0 mg/L6.BA+0.2 mg/L LAA+3％蔗糖+6

10、.5％瓊脂的培養(yǎng)基上番茄子葉的芽誘導率最高，并且誘導芽所需要的時間最短，長出的芽最壯，因此本實驗最終采用MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+3％蔗糖+6.5％瓊脂組合的培養(yǎng)基來誘導番茄子葉發(fā)芽。設(shè)計不同濃度的IAA(0.2～0.5mg/L)，觀察不定芽生根的速度、數(shù)量及生根的質(zhì)量，以確定適于番茄生根的最佳I從濃度，結(jié)果顯示幼苗在不同培養(yǎng)基中都能生根，其中以含0.4 mg/LIAA的培養(yǎng)基生根最快，一周后即出現(xiàn)大量不

11、定根，根系比較壯。 為了測定外植體對Kan的敏感性，在篩選的最佳誘導培養(yǎng)基中，加入不同濃度的kan(0、10、20、30、40、50、60、70 mg/L)測定外植體的分化情況，每個濃度3次重復，每次重復20個外植體，接種觀察不同濃度kan對番茄子葉分化抑制的效果。結(jié)果表明當在濃度為60 mg/L的培養(yǎng)基上，有少量愈傷組織形成，以后逐漸白化、死去，不能分化出芽；含40 mg/L kan．的培養(yǎng)基上多數(shù)外植體形成較多的愈傷組織，大

12、部分可分化出綠芽，并且生長正常；因此本實驗所用番茄材料適宜的篩選壓為kan 50ng/L。 5．轉(zhuǎn)基因番茄的獲得采用農(nóng)桿菌介導法，將攜帶pVCT-PdsRNAi表達載體的新鮮的農(nóng)桿菌菌液用液體MS培養(yǎng)基重懸后，浸染已經(jīng)在分化培養(yǎng)基上預培養(yǎng)兩天的番茄子葉，將經(jīng)農(nóng)桿菌浸染的外植體接種到芽誘導培養(yǎng)基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+30g/L蔗糖+瓊脂6.5g/L)上28℃暗培養(yǎng)2d，然后將外植體轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基

13、(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+30 g/L蔗糖+300mg/I，羧卞青霉素Cb，pH 5.8)上培養(yǎng)7天，然后把抑菌培養(yǎng)7d后的外植體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+30g/L蔗糖+瓊脂6.5g/L+50 mg/L kan+250 mg/L Cb，pH 5.8)上進行選擇培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度26±2℃，光照時間16h/d，光照強度3，000lx。選擇培養(yǎng)2周后，

14、外植體的切口處逐漸分化出抗性不定芽，將這些抗性芽轉(zhuǎn)入(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA+糖30 g/L+瓊脂6.5g/L+50 mg/L kan+200 mg/L Cb．pH 5.8)新鮮選擇培養(yǎng)基中繼續(xù)進行選擇培養(yǎng)，每兩周換一次培養(yǎng)基，其間不斷的降低Cb的濃度。待抗性苗長到3～4cm以上時，從基部切下形成的不定芽，轉(zhuǎn)入MS+0.4 mg/L IAA+30 g/L 蔗糖+50 mg/L的Kan的培養(yǎng)基上生根，7

15、～10d后開始長出不定根，等幼苗長到3～4片葉后，將生根后的植株開瓶煉苗3～5d，移栽到人工氣候室中讓其自然生長直到結(jié)果。 6．轉(zhuǎn)基因植株的檢測通過抗性篩選，本實驗共獲得了7株轉(zhuǎn)化再生植株，分別提取這7株植株的DNA進行PCR檢測，反應體系同擴增Lcy片段一樣，反應條件只由72℃延伸1min變?yōu)?2℃延伸2min外，其他條件不變。其中5株擴增出了預期的條帶，表明外源基因已經(jīng)整合到了番茄基因組中，將鑒定為正確的轉(zhuǎn)基因植株移栽到人工

16、氣候室中，讓其自然生長直到結(jié)果，獲得轉(zhuǎn)基因番茄果實。在農(nóng)桿菌浸染過程中，農(nóng)桿菌太濃，在后來的培養(yǎng)中外植體容易褐化、壞死；農(nóng)桿菌太稀獲得的抗性植株的機會就減少，因此，應適當掌握農(nóng)桿菌的浸染濃度，本實驗結(jié)果認為農(nóng)桿菌菌液濃度的0D值在0.3～0.6之間是最適合浸染番茄外植體的濃度，同時用液體Ms培養(yǎng)基重懸農(nóng)桿菌是很必要的，可以降低農(nóng)桿菌對外植體的毒害，增加外植體的成活率。 7．轉(zhuǎn)基因番茄中番茄紅素含量的測定收獲轉(zhuǎn)色期20天后的完全紅

17、熟的番茄果實每株兩個，研磨成糊以后，每株稱取10g番茄糊，加入適量的氯仿在35~C避光提取4小時，離心，轉(zhuǎn)移下層液體至一新的50mL的離心管中，然后向番茄殘渣中再加入適量氯仿重復抽提2次，最后用氯仿定容到50mL。將提取的番茄紅素溶液迅速用U-1800型紫外分光光度計在502nm的波長下測定番茄紅素含量<'[135]>，氯仿做參比，每個材料重復3次，測得一系列吸光度值，取平均值計算番茄紅素含量。測定結(jié)果表明所獲得的5株轉(zhuǎn)基因番茄果實的番