大鼠肝臟冷缺血再灌注損傷后共刺激分子B7-1，B7-2表達的實驗研究.pdf

1、【研究背景】 肝移植是當今治療終末期肝病的唯一有效方法，然而目前在肝移植領域面臨著兩大難題，即供肝的缺血再灌注損傷和免疫排斥反應。肝臟冷缺血再灌注損傷為肝臟移植的重要病理生理過程，它存在于肝臟的切取，保存，以及移植手術的各個環(huán)節(jié)。缺血再灌注損傷影響移植后肝臟的功能，與更為嚴重的原發(fā)性無功能有密切關系，并且增加了發(fā)生急性排斥反應的幾率。此前雖然對Kupffer細胞和T淋巴細胞浸潤于缺血再灌注損傷的肝組織已有許多相關報道，但關于共刺

2、激分子在冷缺血再灌注損傷肝組織的表達情況及其潛在作用仍尚未闡明。 T細胞活化與增殖依賴于雙信號：當T細胞受體(TCR)與存在于抗原呈遞細胞(APC)表面的主要組織相容性復合肽復合物( MHC)相結合后，第一信號被激活；第二信號為共刺激信號，當T細胞表面的共刺激分子受體與其配體相結合后，第二信號被激活，而B7-1(CD80)、B7-2(CD86)即是存在于抗原呈遞細胞表面的重要配體。當T細胞僅有第一信號時，T將會處于一種特異性的無

3、能狀態(tài)。CD28是位于T細胞表面的一個共刺激分子B7的受體，通過它的介導，可刺激T細胞擴增、促使細胞因子分泌，保持T細胞的反應狀態(tài)。在體內(nèi)或體外運用細胞毒T淋巴細胞相關抗原4融合蛋白(CTLA4-Ig)阻斷CD28與B7-1(CD80)和/或B7-2(CD86)結合[2,4-13]，將會抑制T細胞激活，從而在實驗性的同種異體器官移植模型中抑制急性或慢性排斥反應的發(fā)生。 從Takada和Chandraker A．等研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細

4、胞共刺激通路參與了腎缺血再灌注損傷，眾多目光投向了共刺激分子在器官冷缺血再灌注損傷中的表達。而在肝移植手術中，供體肝臟在摘取、灌洗、保存、血流開放等一系列環(huán)節(jié)中，供體肝臟都會受到冷缺血再灌注損的打擊。本實驗將從免疫學角度來對大鼠肝臟冷缺血再灌注損傷進行研究，應用免疫組織化學和RT-PCR半定量技術分別檢測B7-1和B7-2蛋白及B7-1和B7-2mRNA的表達情況，從而進一步探討冷缺血再灌注與肝臟移植急性排斥反應的聯(lián)系，同時對抑制或減輕

5、與冷缺血再灌注有關的肝移植早期急性排斥反應提出新的預防策略。就所查的文獻，國內(nèi)尚未檢索到關于冷缺血再灌注后共刺激分子表達與肝移植早期急性排斥反應研究的論文或報道。 【目的】探討共刺激分子B7-1和B7-2在大鼠肝臟冷缺血再灌注損傷模型中的表達及其免疫學意義。 【方法】 1．健康雄性Wistar大鼠30只，體重200-250克，購自山東大學動物試驗中心。將30只大鼠隨機分為3組：A組為假手術組(對照組)；B組為冷缺

6、血20min再灌注24h組；C組為冷缺血30min再灌注24h組。 2．動物模型的建立參照胡建平[14]的方法：術前禁食12小時，不禁水，乙醚丌放吸入麻醉。B、C組分別用4℃乳酸林格氏液灌注，A組作正常對照。脾靜脈和右腎上腺靜脈分別作為灌注液流入和流出道，行在體原位低溫灌注，冷缺血時間分別為30min和60rain。B組和C組分別于再灌注24h取肝臟組織，A組于關腹后24h采集肝左葉組織標本。 3．逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(R

7、T-PCR)半定量：采用Trizol(加拿大BBI公司產(chǎn)品)試劑盒提取組織標本總RNA，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，β-actin、B7-1和B7-2的引物序列參照Naosuke Kojiima的文獻報道，由山東省醫(yī)學科學院協(xié)助合成。β-actin上游引物為：5’-ATGGARTCCTGTGGCATCCA-3’，下游引物為：5’-CGCTCAGGAGGAGCAATGAT-3,擴增產(chǎn)物224bp；B7-1上游引物為：5’GGC

8、ATTGCTGTCCTGTGATTAC 3’，下游引物為：5’ACTCAGTTATGTTGGGGGTAGG 3’，擴增產(chǎn)物314bp；B7-2上游引物為：5’GCTCGTAGTATTTTGGCAGGACC 3’，下游引物為：5’CGGGTATCCTTGCTTAGATGAGC 3’，擴增產(chǎn)物337bp。兩步法RT-PCR反應檢測B7-1、B7-2 mRNA表達。1％瓊脂糖凝膠電泳，Alpha Imager TM 2200凝膠成像系統(tǒng)觀察電

9、泳條帶存入圖像。以系統(tǒng)的SPOT DENSITY軟件分別測量內(nèi)參照和B7-1、B7-2基因擴增條帶的密度，以B7-1、B7-2條帶的密度與內(nèi)參照管家基因的密度比值代表基因表達的相對水平，作擴增產(chǎn)物半定量分析。 4．免疫組化：應用免疫組織化學SABC法，檢測30例肝臟組織中B7-1、B7-2蛋白表達情況，分析B7-1、B7-2蛋白表達與肝臟冷缺血再灌注損傷有關的排斥反應的關系。 【結果】 1．B7.1 mRNA在B

10、，C組表達為0.529±0.089和0.618±0.074，均較A組(0.1314±0.012)明顯增高。B7-2mRNA在B組、C組表達為0.474±0.132和0.682±0.095，均較A組(0.163±0.054)明顯增高。 2．B7-1、B7-2 mRNA的表達水平在B組和C組之間具有顯著性差異，C組高于B組。 3．B7-1蛋白在B，C組表達為170.600±23.717和216.100±24.740，均較A組

11、(127.800±12.541)明顯增高；B7-2蛋白在B，C組表達為189.800±19.971和239.000±21.328，均較A組(131.700±22.969)明顯增高。 4．B7-1、B7-2蛋白表達水平在B組和C組之間具有顯著性差異，C組高于B組。 【結論】 1．冷缺血再灌注大鼠之肝臟，共刺激分子B7-1和B7-2 mRNA的表達明顯上調(diào)；冷缺血再灌注大鼠肝臟之免疫原性由于B7-1和B7-2mRNA