人類內源性抗菌肽LL-37在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，但確切發(fā)病機制尚不完全明了，造成防治上的困難。因而COPD發(fā)病機制一直是該領域研究的熱點。COPD是一種慢性氣道炎癥性疾病，以不完全可逆的氣流受限為特征，氣流受限呈進行性發(fā)展，是肺部對于有害顆?；驓怏w的異常的炎癥反應。近年來的研究表明，天然免疫和獲得性免疫均發(fā)揮了重要的作用

2、，但中性粒細胞和巨噬細胞釋放的炎癥介質和蛋白酶成分在COPD發(fā)病中的作用似乎更為突出，研究人員推測天然免疫可能與COPD炎癥損傷和組織重塑關系更為密切。人類內源性抗菌肽LL-37作為天然免疫系統的重要組成成分，是機體抵抗外界刺激的第一道防線。除傳統的抗菌作用外，趨化活性、損傷修復、影響細胞凋亡及細胞毒性等多項功能日益引起人們的關注。我們在前期研究基礎及回顧文獻基礎上，推測，具有廣譜多效生物學功能的LL-37可能在COPD發(fā)病過程中發(fā)揮重

3、要作用。對其狀態(tài)的研究也有助于揭示天然免疫在COPD發(fā)病過程中的作用。
　　 目的：
　　 檢測COPD患者血清、誘導痰及肺組織標本中人類內源性抗菌肽LL-37的表達，并于細胞水平觀察人支氣管上皮細胞(BEP2D)、肺泡上皮細胞(A549)經香煙提取物(CSE)及細菌成分脂多糖(LPS)刺激前后LL-37的表達及LL-37合成多肽對BEP2D、A549炎癥因子釋放及細胞凋亡等的影響，以探討內源性抗菌肽LL-37在COPD

4、發(fā)病機制中的作用。
　　 方法：
　　 1.選取穩(wěn)定期COPD患者28例，健康吸煙者14例，健康非吸煙者18例，采集患者空腹外周血及誘導痰，ELISA方法檢測血清及誘導痰中LL-37的水平。并行肺功能檢測，填寫圣喬治問卷以評價受試者生活質量，行6分鐘步行試驗以評價運動耐量。2.選取因肺部腫瘤、肺大皰、肺囊腫而行手術治療的COPD患者9例，肺功能正常者10例，免疫組化方法檢測肺組織標本LL-37的表達。3.培養(yǎng)人支氣管上皮

5、細胞(BEP2D)及肺泡上皮細胞(A549)，使用不同濃度的CSE及LPS刺激細胞，免疫熒光化學染色，激光共聚焦顯微鏡檢測BEP2D、A549經CSE、LPS刺激前后LL-37蛋白的表達。4.以不同濃度的LL-37合成多肽刺激BEP2D、A549細胞，ELISA方法檢測炎癥因子白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平，流式細胞儀檢測LL-37對BEP2D、A549細胞凋亡的影響，半自動生化分析儀檢測細胞培養(yǎng)上清液

6、中乳酸脫氫酶(LDH)的水平。
　　 結果：
　　 1.ELISA結果顯示Ⅰ+Ⅱ級COPD及Ⅲ+Ⅳ級COPD患者誘導痰中LL-37水平顯著高于健康非吸煙組(P<0.05)及健康吸煙組(P<0.05)。Ⅲ+Ⅳ級COPD組誘導痰中LL-37顯著高于Ⅰ+Ⅱ級COPD組(P<0.05)。外周血中LL-37水平于各組間未見顯著性差異。誘導痰中LL-37水平與患者肺功能FEV1％呈負相關(r=-0.32，P=0.01)，與6分鐘步行

7、試驗呈負相關(r=-0.27，P=0.01)，與圣喬治問卷評分呈正相關(r=0.35，P=0.01)。
　　 2.免疫組織化學結果顯示，LL-37主要表達于肺內的氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞、炎癥細胞(包括中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞)和成纖維細胞；COPD組支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞及炎癥細-胞LL-37呈強陽性表達，而對照組支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞及炎癥細胞LL-37呈弱陽性表達。
　　 3.細胞免疫熒光化學染

8、色，激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，分別經不同濃度的CSE和LPS刺激后，BEP2D細胞、A549細胞LL-37呈顯著增強的陽性表達。
　　 4.ELISA結果顯示LL-37合成多肽可促進BEP2D、A549細胞炎癥因子IL-8的釋放(P<0.05)；流式細胞儀結果顯示LL-37合成多肽可誘導BEP2D、A549細胞的凋亡，呈劑量-效應和時間-效應關系；LL-37合成多肽可增加BEP2D、A549細胞LDH的分泌。
　　

9、結論：1.COPD患者誘導痰中升高的LL-37與患者氣流受限程度，生活質量及運動耐量顯著相關，COPD患者肺組織中LL-37表達亦明顯增強，推測它們可能作為COPD疾病活動和進展的預測指標，有可能為COPD的治療提供新的靶點。
　　 2.暴露于CSE、LPS的支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞LL-37的表達明顯增加；
　　 3.LL-37合成多肽可促進支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞炎癥因子的釋放，誘導支氣管上皮細胞、肺泡上皮細