口蹄疫病毒非結(jié)構蛋白2B的離子孔道特性研究.pdf

1、病毒離子孔道蛋白(Viroporins)是由病毒編碼的一類小分子量、疏水性跨膜蛋白。它們一般由50-120個氨基酸殘基組成，至少有一個疏水性跨膜結(jié)構域。這些疏水性跨膜區(qū)能夠與宿主細胞內(nèi)的磷脂雙分子層相互作用并使磷脂雙分子層擴散。離子孔道蛋白參與破壞宿主細胞的形態(tài)并擾亂宿主細胞的生理學功能以保證病毒能夠完成其完整的生命周期。小RNA病毒科腸道病毒屬病毒編碼的2B蛋白具有寡聚化形成跨膜孔道、增加宿主細胞膜通透性、擾亂宿主細胞Ca2+體內(nèi)平衡

2、、誘導宿主細胞發(fā)生自噬以及誘導宿主細胞的凋亡等viroporin特性。本研究中，以小RNA病毒科腸道病毒屬中的脊髓灰質(zhì)炎病毒和柯薩奇病毒的2B蛋白研究為參考，借鑒多種病毒離子孔道蛋白的研究方法，對口蹄疫病毒非結(jié)構蛋白2B的結(jié)構特性和功能展開初步研究。
　　1.運用在線預測軟件對2B蛋白氨基酸序列進行預測，結(jié)果顯示，亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒2B基因含有462 bp，總共編碼154個氨基酸。整條肽鏈擁有兩個疏水區(qū)，分別為氨基酸83-104和

3、氨基酸119-137。構建pXJ-FLAG-2B，pXJ-2B-HA及pXJ-2B△(110-111)等帶有不同標簽的重組質(zhì)粒在BHK-21細胞中表達，并采用0.01％ TritonⅩ-100和洋地黃皂苷(0.01mg/mL)對細胞的處理，確定了2B蛋白的跨膜方式與ⅡA型viroporin的跨膜方式一致。構建帶有綠色熒光標簽的重組質(zhì)粒pEGFPN1-2B在BHK-21細胞中表達，并采用激光共聚焦顯微鏡的觀察，確定了2B蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

4、構建帶有SUMO標簽的重組質(zhì)粒pSMK-2B在大腸桿菌C43(DE3)中表達并純化，經(jīng)戊二醛作用，2B蛋白單體之間出現(xiàn)了不同程度的寡聚化作用，確定了2B蛋白在細胞外能夠相互作用;同時，免疫共沉淀實驗顯示，帶有不同標簽的2B蛋白單體間出現(xiàn)寡聚化作用，確定了2B蛋白在BHK-21細胞內(nèi)也能夠相互作用。2B蛋白的這些結(jié)構特性與viroporin的一般結(jié)構特性相一致。
　　2.通過對比空載體質(zhì)粒pSMK以及重組質(zhì)粒pSMK-2B在大腸桿菌

5、BL21(DE3)和C43(DE3)的表達以及兩種重組菌株的增殖情況。結(jié)果顯示，2B蛋白只在毒性耐受性更強的大腸桿菌C43(DE3)菌株中表達，而且與大腸桿菌C43(DE3)相比，大腸桿菌BL21(DE3)的增殖明顯受到抑制。這證明了2B蛋白對原核細胞有一定的毒性作用。將重組質(zhì)粒pXJ-FLAG-2B或pXJ-2B-HA轉(zhuǎn)入BHK-21細胞，2B蛋白在BHK-21細胞中表達后，破壞了細胞膜結(jié)構的完整性，并引起了細胞內(nèi)Ca+濃度的顯著升高