大鼠神經(jīng)元缺氧缺糖損傷后calpain1及αⅡ-Spectrin表達(dá)變化規(guī)律.pdf

1、目的：
　　 顱腦損傷是法醫(yī)實(shí)踐工作中常見而嚴(yán)重的損傷類型，不同類型的顱腦損傷常伴有不同類型及不同程度的神經(jīng)元損傷，顱腦損傷發(fā)生后的繼發(fā)性神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制一直為國(guó)內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注。
　　 本研究通過進(jìn)行大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)，在純化神經(jīng)元的理想狀態(tài)下，化學(xué)性作用建立OGD損傷模型，動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)元損傷后不同時(shí)間形態(tài)學(xué)特征，并采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)、Western blot等方法，在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)calpainl及其

2、底物蛋白αⅡ-spectrin(240kDa)，以及αⅡ-spectrin的裂解片段SBDPs(150kDa和120kDa)在蛋白水平表達(dá)的時(shí)間規(guī)律性，進(jìn)一步分析calpainl和αⅡ-spectrin在腦損傷后的繼發(fā)性神經(jīng)元損傷中所起作用，為法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用生物學(xué)標(biāo)記蛋白calpainl和αⅡ-spectrin推斷腦損傷形成時(shí)間提供一定的實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　 選擇出生后1～2天的Wistar大鼠，

3、取大腦皮質(zhì)組織，剪碎，0.25％的胰酶消化，離心棄去上清，用含10％馬血清、10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮沉淀組織，過濾使之成為單細(xì)胞懸液，按2×106個(gè)/ml的密度接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的六孔培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2天后加入為終濃度10μmol/L阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細(xì)胞、纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞的生長(zhǎng)；神經(jīng)元培養(yǎng)至第8天時(shí)，隨機(jī)分為對(duì)照組及若干損傷組，損傷組神經(jīng)元用含0.5mmol/L連二亞硫酸鈉的低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行

4、缺氧缺糖損傷，作用30分鐘后更換為正常培養(yǎng)基分別繼續(xù)培養(yǎng)0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、96h;對(duì)照組細(xì)胞只常規(guī)換液一次。對(duì)照組及損傷組神經(jīng)元分別進(jìn)行活細(xì)胞倒置顯微鏡觀察、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色、Western blot檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用原代培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元，進(jìn)行缺氧缺糖損傷，通過活細(xì)胞倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元缺氧缺糖損傷后形態(tài)學(xué)發(fā)生了一系列改變。對(duì)照組神經(jīng)元形態(tài)較好，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整

5、，邊緣折光性強(qiáng)，周圍光暈明顯，胞體豐滿，呈類圓形、近三角形及多極形，樹突、軸突較長(zhǎng)并相互交織成網(wǎng)，核仁明顯，呈圓形。OGD損傷即刻，細(xì)胞形態(tài)基本沒有明顯改變，細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)少量空泡狀結(jié)構(gòu)。傷后1h，大部分神經(jīng)元仍保持原有形態(tài)，少數(shù)細(xì)胞胞體周圍光暈變暗，突起縮短。傷后6h-12h，神經(jīng)元胞體明顯皺縮，多數(shù)細(xì)胞突起縮短，甚至消失，光暈減弱甚至消失，培養(yǎng)基質(zhì)中細(xì)胞碎屑增多。傷后24h-48h，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)不清，大部分突起崩解，部分細(xì)胞僅剩下

6、殘存痕跡，培養(yǎng)基質(zhì)顏色變淡、質(zhì)地較均勻，細(xì)胞碎片明顯增多。傷后96h，部分細(xì)胞有所恢復(fù)，細(xì)胞數(shù)量少，胞體形態(tài)漸清，突起少但較為粗大。
　　 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示calpain1和αⅡ-spectrin共同表達(dá)于大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的胞體和突起中。
　　 Western blot結(jié)果顯示calpainl、底物αⅡ-spectrin及其裂解片段在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中均有表達(dá)并隨時(shí)間呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律。與對(duì)照組相比，c

7、alpainl表達(dá)在傷后1h即有下降，并在6h達(dá)到最小值，傷后12h較6h有所回升，24h及以后各組基本恢復(fù)到正常水平；細(xì)胞骨架蛋白αⅡ-spectrin在損傷即刻即有增加，后呈下降趨勢(shì)，在傷后6h達(dá)到最大值，至傷后96時(shí)仍顯著高于對(duì)照組；calpainl和caspase3介導(dǎo)的αⅡ-spectrin裂解片段SBDP150在傷后3h有顯著增加，并在傷后12h達(dá)到最大值，后呈下降趨勢(shì)，傷后48h仍高于對(duì)照組，96h后與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

8、義；caspase3介導(dǎo)裂解αⅡ-spectrin產(chǎn)生的SBDP120片段在損傷即時(shí)表達(dá)較對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在傷后1h即有顯著增加，3h、6h、12h、24h、48h及96h與對(duì)照組比較均有顯著增加，并于12h達(dá)到最大值。
　　 皮質(zhì)神經(jīng)元在OGD損傷后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、calpainl及其底物蛋白的變化均表現(xiàn)出明顯的時(shí)間規(guī)律性，這種變化規(guī)律可為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中推斷腦損傷形成時(shí)間提供一定的理論依據(jù)。
　　 結(jié)論：
　　

9、 1、在連二亞硫酸鈉致缺氧缺糖損傷模型中大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生連續(xù)而明顯的形態(tài)學(xué)改變，其改變具有明顯的時(shí)間規(guī)律性。
　　 2、缺氧缺糖損傷后大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中鈣依賴性蛋白酶calpain1、αⅡ-spectrin及其裂解片段SBDPs的表達(dá)水平存在一定的時(shí)間變化規(guī)律，此種變化規(guī)律可用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中推斷腦損傷形成時(shí)間。
　　 3、caspase3介導(dǎo)的αⅡ-spectrin裂解產(chǎn)物SBDP120表達(dá)改變出現(xiàn)早，提示神經(jīng)元OGD