玉米自交系淀粉合成及其關鍵酶活性變化與玉米sbe的克隆與表達.pdf

1、玉米淀粉是化學成分最佳淀粉之一，純度達99．5％，全世界淀粉80％以上來自于玉米。玉米淀粉在食品、醫(yī)藥、化工、紡織、造紙、建筑、石油化工和塑料工業(yè)等領域具有廣泛的用途?，F(xiàn)在，隨著世界經濟的發(fā)展、人口的激增及資源的巨大損耗，使淀粉這種天然資源的研究變得更加迫切和重要。深入研究玉米籽粒淀粉形成的生理機制，可以為以后通過生物技術提高淀粉產量，改良淀粉品質奠定基礎，對培育高淀粉、高品質專用型玉米具有重要意義。本研究以兩個高淀粉和兩個低淀粉玉米自

2、交系為材料，對高淀粉玉米自交系與低淀粉自交系在籽?？偟矸?、直鏈淀粉、支鏈淀粉及蛋白質含量的動態(tài)積累以及籽粒灌漿過程中淀粉生物合成關鍵酶活性的動態(tài)變化進行了比較研究，同時對關鍵酶活性的動態(tài)變化與淀粉積累的相關性進行討論分析。并且通過優(yōu)化淀粉結合蛋白的分離純化方法，探討了高、低淀粉玉米自交系淀粉結合蛋白的表達差異，同時還通過反轉錄方法克隆了高淀粉玉米自交系415084-2的sbel和sbe2b的cDNA，構建表達載體，在大腸桿菌中誘導表達，

3、為在體外研究SBE的理化性質、催化機理，探討SBE在玉米籽粒淀粉生物合成的分子機理奠定了基礎。研究結果表明： 1．灌漿過程中4個自交系淀粉(總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉)含量變化趨勢均呈“S”曲線變化。高、低淀粉玉米自交系灌漿初期籽粒直鏈淀粉含量并無顯著差異，而是在灌漿中后期才逐漸表現(xiàn)差異，直鏈淀粉合成啟動時間和積累速率的大小最終決定籽粒直鏈淀粉的含量；而支鏈淀粉含量的差異在灌漿初期就已形成，高淀粉自交系支鏈淀粉的初始積累速率比低

4、淀粉自交系大，支鏈淀粉含量與其最大積累速率并沒有必然聯(lián)系；兩個高淀粉自交系的淀粉含量及積累速率在30 DAP(Days After Pollination，授粉后天數(shù))以前都高于兩個低淀粉自交系。 2．灌漿過程中4個自交系ADPGPPase(腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶)、SSS(可溶性淀粉合成酶)、GBSS(顆粒結合淀粉合成酶)活性均呈單峰曲線變化，峰值都出現(xiàn)在20-30DAP(授粉后天數(shù))。兩個高淀粉自交系415084．2和3

5、14068-4的SBE(淀粉分支酶)活性呈單峰曲線變化，都在20DAP達到峰值；兩個低淀粉自交系314168-2和315062-1的SBE活性則呈雙峰曲線變化。灌漿過程中兩個高淀粉自交系的SSS和GBSS活性顯著高于兩個低淀粉自交系，4個自交系灌漿過程中SSS活性變化與支鏈淀粉含量變化一致。 3．4個自交系籽粒中直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉的積累速率與各自交系灌漿期ADPGPPase、SSS和GBSS的活性變化均呈顯著或極顯著正相

6、關；除了314168-2的SBE活性變化與淀粉積累速率呈顯著正相關外，其它自交系SBE活性變化與淀粉積累速率相關性均不顯著。各自交系關鍵酶活性之間，ADPGPPase、SSS和GBSS三者間活性變化均呈顯著或極顯著正相關，這3種酶活性變化與SBE活性變化也呈不同程度的正相關。說明ADPGPPase、SSS、GBSS在催化籽粒淀粉合成可能形成多酶復合體協(xié)同起催化作用。 4．玉米籽粒最終的蛋白質含量主要取決于灌漿后期的回升速率，與前

7、期含量的關系不明顯：灌漿前期，過高的蛋白質含量將影響淀粉的積累，而成熟期蛋白質含量對淀粉積累的影響不大。灌漿過程中各自交系蛋白質含量與總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉含量間呈負相關。 5．從SGAPs(Starch Granule-Associated Protein淀粉結合蛋白)提取條件來看，SDS(十二烷基硫酸鈉)對于SGAPs(淀粉結合蛋白)的分離純化十分重要。研究表明不同濃度SDS提取的樣品SBEⅡb，SSI，GBSSI，ze

8、in含量不一樣，其中10％的SDS緩沖液對SBEⅡb，SSI，GBSSI，zein蛋白的提取含量最大，而且提取SGAPs總量也高，說明提取SGAPs時的最適SDS緩沖液濃度為10％。在煮沸時間的確定中，煮沸5 rain時提取的SGAPs明顯比其它時間總蛋白量最高，但目的帶含量并不高，煮沸2-3 min時SBEIIb，SSI，GBSSI蛋白質含量較高，但蛋白總量并不高。說明隨著煮沸時間的延長，蛋白提取量的增大主要是由于zein蛋白提取量增

9、加而引起的，而目的蛋白的含量并沒有顯著提高，尤其是GBSSI蛋白含量是在煮沸2-3 min時最高。 6．從高、低淀粉自交系SGAPs動態(tài)表達上來看，在15-35 DAP時，提取SGAPs的總量出現(xiàn)兩頭低中間高的趨勢，并且在20-30 DAP時達到穩(wěn)定，高、低淀粉玉米自交系GBSSI蛋白的表達規(guī)律基本相同，但SBEⅡb、SSI、zein蛋白表達差別很大。 7.根據(jù)GenBank公布sbe1和sbe2b cDNA序列，分別設

10、計了兩對含有酶切位點的引物，克隆了高淀粉自交系415084-2的sbe1和sbe2b cDNA。它們堿基序列和GenBank上序列同源性達99％，并對SBEI和SBEⅡb蛋白的二、三級結構進行了預測。PredictProtein預測SBEI的14.82％的氨基酸殘基形成由6個a螺旋(a helix)，19.32％氨基酸殘基形成15個β折疊，其余65.86％的氨基酸殘基形成33個隨機卷曲(random coil)，54.56％氨基酸殘基處

11、于蛋白質表面。PredictProtein預測SBE Ⅱ b蛋白的14.39％的氨基酸殘基形成7個a螺旋，18.90％氨基酸殘基形成17個β折疊，其余66.71％的氨基酸殘基形成37個隨機卷曲(random coil)，57.45％氨基酸殘基處于蛋白質表面。由于SBE I和SBE Ⅱ b蛋白α螺旋含量較少，說明它們可能都是親水的蛋白質。SWISS-MODEL軟件對這兩個蛋白的三級結構進行預測，結果顯示它們都是球狀蛋白質，而且有些相似。