海水魚類主要弧菌鑒定和毒力基因檢測(cè)的膜芯片技術(shù).pdf

1、弧菌廣泛分布于近海及河口的海洋環(huán)境，已經(jīng)證明有多種弧菌是魚類的重要條件性致病菌?；【∈且鹑蛩a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害泛濫、造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的魚類細(xì)菌病?；【闹虏C(jī)理與它攜帶幾種重要毒力基因有關(guān)，這些毒力基因編碼不同的毒力因子，分別行使不同的功能，共同協(xié)作形成一套復(fù)雜的致病機(jī)制。在20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的基因芯片技術(shù)，是高通量、微型化和自動(dòng)化的新型分子生物學(xué)技術(shù)，是基因功能研究的有力工具。將該技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物病害監(jiān)測(cè)，進(jìn)行快速有效的早期診

2、斷對(duì)防治工作來(lái)說(shuō)是很重要的。 采用十字交叉劃線法、點(diǎn)種法和平板擴(kuò)散法從160株海洋細(xì)菌中篩選出1株對(duì)鰻弧菌和哈維氏弧菌的生長(zhǎng)有一定抑制作用的海洋細(xì)菌2004103101。將病原菌接種到2004103101菌的除菌培養(yǎng)上清中，設(shè)定對(duì)照組，通過(guò)在不同培養(yǎng)時(shí)間測(cè)量培養(yǎng)液的OD<,600>再次確認(rèn)其培養(yǎng)上清中是否含有抑制病原菌生長(zhǎng)的物質(zhì)。結(jié)果顯示，這株菌對(duì)兩種病原菌均有一定的生長(zhǎng)抑制作用。2004103101菌革蘭氏染色陰性，彎曲短桿狀

3、，TCBS培養(yǎng)基上菌落呈半透明黃色濕潤(rùn)扁圓形，有較強(qiáng)的體外溶血性，生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌與鰻弧菌相似。進(jìn)一步對(duì)其16S rRNA的序列進(jìn)行PCR測(cè)序和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示2004103101菌與鰻弧菌自然聚類，親緣關(guān)系最近。綜合上述結(jié)果可將2004103101菌鑒定為鰻弧菌。將這種拮抗菌對(duì)大菱鲆進(jìn)行腹腔注射感染實(shí)驗(yàn)，以注射鰻弧菌和海水魚用生理鹽水分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，經(jīng)過(guò)14天的觀察和結(jié)果分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這株菌的毒力相對(duì)于鰻弧菌而

4、言是很低的。為進(jìn)一步探討其毒力損失原因，針對(duì)鰻弧菌的毒力表型相關(guān)基因vah，empA，virC，virA，flaA和angM以及16S rRNA設(shè)計(jì)了7對(duì)PCR引物，以鰻弧菌和2004103101菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)與鰻弧菌相比較，2004103101菌缺失與表面抗原合成有關(guān)的virC基因，并且angM基因擴(kuò)增片斷的數(shù)量和大小也與鰻弧菌有一定不同。angM基因是鰻弧菌質(zhì)粒pJM1和pEIB1所共有的，編碼非核糖體多

5、肽合成酶。 利用基因芯片高通量、平行性的特點(diǎn)，選擇針對(duì)各弧菌的16S rRNA、hsp60和2至6個(gè)不等的毒力相關(guān)基因，設(shè)計(jì)了由29個(gè)探針組成的寡核苷酸芯片和28對(duì)基因特異性引物。利用國(guó)際生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站 (http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/)進(jìn)行每個(gè)基因序列的BLAST搜索和相關(guān)文獻(xiàn)的檢索，檢索到各基因的同源序列后，再將各基因與其同源序列用omiga軟件進(jìn)行比對(duì)，找出保守區(qū)和特異區(qū)，分別處理保存后導(dǎo)入

6、AlleleID 3.0軟件或Array Designer 4.0軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為200-500bp的引物和長(zhǎng)度為45-55bp的探針。將設(shè)計(jì)好的探針再全部導(dǎo)入omiga軟件進(jìn)行比對(duì)，確定探針之間最多不超過(guò)四個(gè)連續(xù)堿基相同，而且位置剛好處于引物擴(kuò)增區(qū)，然后交由基因公司合成。將合成后的探針按照設(shè)定的位置分布用手動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)在尼龍膜上，經(jīng)紫外交聯(lián)后固定在膜上組成寡核苷酸膜芯片。 用酚-氯仿抽提法提取細(xì)菌總DNA作為PCR的

7、模板，然后用基因特異性引物加入地高辛標(biāo)記的(dUTP擴(kuò)增并標(biāo)記各菌株的待測(cè)目的片段，標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢查后測(cè)定標(biāo)記產(chǎn)量，然后配制成20ng/ml的雜交液同時(shí)與膜芯片進(jìn)行雜交，對(duì)雜交時(shí)間、PCR產(chǎn)物濃度設(shè)計(jì)梯度試驗(yàn)以優(yōu)化反應(yīng)條件，檢測(cè)芯片的靈敏度。雜交結(jié)束后的反應(yīng)信號(hào)用NBT-BCIP液顯色后進(jìn)行分析。 試驗(yàn)結(jié)果顯示其中12個(gè)毒力相關(guān)基因均能特異性顯色，無(wú)其它交叉反應(yīng)，可以作為菌株是否含有該毒力基因的檢測(cè)方

8、法，作為菌株是否致病的重要參考指標(biāo)，而每種弧菌的16S rRNA和hsp60探針點(diǎn)(共10個(gè))則都會(huì)與其它一至三種弧菌的16S rRNA、hsp60發(fā)生交叉反應(yīng)(溶藻膠的hsp60除外)，其反應(yīng)信號(hào)不能作為菌種準(zhǔn)確鑒定的依據(jù)，只能作為菌株是否是弧菌的鑒定依據(jù)。試驗(yàn)中溶藻膠弧菌的omp、副溶血弧菌的trh、費(fèi)氏弧菌的ampC在PCR反應(yīng)中能很好的擴(kuò)增出單一的目的條帶，但在雜交信號(hào)中沒(méi)有出現(xiàn)顯色反應(yīng)。試驗(yàn)中費(fèi)氏弧菌的omp和cnf,燦爛弧菌