mELC重組腺病毒聯(lián)合緩釋脂質體治療惡性腹水的研究.pdf

1、EB病毒誘導的分子1配體趨化因子(EBV-induced moleculel ligand chemokine，mELC)屬于CC類趨化因子。能趨化DC、T細胞、B細胞、NK細胞及巨噬細胞祖細胞等。mELC通過與其受體CCR7的相互作用，促進DC細胞與T細胞接觸并呈遞抗原從而激發(fā)有效的免疫反應。在基因治療中，腺病毒是應用最廣泛的病毒載體之一，但是腺病毒具有較強的免疫原性，重復治療往往導致目的基因在體內表達量的下降，最終影響治療結果。本實

2、驗構建了小鼠ELC的復制缺陷型重組腺病毒(Ad-mELC)，采用PEG修飾的陽離子脂質體(PEG-liposome)聯(lián)合Ad-mELC治療小鼠惡性腹水，并對其抗腫瘤機制進行了初步探討。 本實驗采用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭質粒pShuttle和骨架質粒pAdEasy-1，經(jīng)過在細菌BJ5183內同源重組構建重組腺病毒載體pAd-mELC。 pAd-mELC在包裝細胞293中包裝成熟的腺病毒顆粒。通過噬斑篩選和PCR鑒定重組

3、腺病毒為復制缺陷型，未含有復制型腺病毒(Replicaton competent ade- novirus，RCA)。然后用RT-PCR和Western blot方法對Ad-mELC的體外表達研究顯示，Ad-mELC表達的mELC的趨化活性通過趨化實驗進行了驗證，表明Ad-mELC表達的蛋白mELC能分泌到細胞外，并對淋巴細胞具有趨化活性，并且該活性可以被相應mELC單克隆抗體阻斷。同時合成PEG修飾的緩釋脂質體PEG-liposome

4、，測定脂質體的平均粒徑為151nm，zeta電位38.6mV，性質比較穩(wěn)定。并用MTT法分別測定了Ad-mELC和PEG-liposome對腫瘤細胞增殖活性的影響。結果顯示Ad-mELC在感染復數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)為50-800的范圍內對細胞增殖無明顯影響(P>0.1)，而且當PEG-liposome對細胞的作用濃度為25ng/10<'3>細胞時，對細胞也無明顯毒性(P>0.1)。隨后建立小鼠

5、纖維肉瘤MethA腹水模型和肝癌腹水模型，設定荷瘤小鼠的治療劑量為：Ad-mELC 5×10<'8>pfu/mouse，PEG 0.1mg/mouse。Ad-mELC聯(lián)合PEG進行治療(Ad-mELC/PEG)，并設立相應對照組(PBS，PEG，Ad-null，Ad-null/PEG，Ad-mELC)。治療方案分為早期治療(小鼠腹腔接種腫瘤2d后開始治療)和晚期治療(小鼠腹腔接種腫瘤5d后開始治療)兩種。觀察小鼠生存期，結果顯示，早期治

6、療方案的MethA腹水模型和肝癌腹水模型中，Ad-mELC/PEG組小鼠存活率分別為100％和70％，Ad-mELC組小鼠40d存活率分別為70％和50％，其他對照組在腹腔接種腫瘤后10天相繼死亡。在晚期治療方案中，MethA腹水模型的PBS組小鼠平均生存期為11.2d，Ad-mELC治療組平均生存期為24d。Ad-mELC/PEG治療組小鼠生存期為31.2d，比對照PBS組平均延長了20d，比單純Ad-mELC治療組延長7.2d；在肝

7、癌腹水模型中，PBS對照組小鼠平均生存期為14d，Ad-mELC治療組平均生存期為21.6d。Ad-mELC/PEG治療組小鼠生存期為28d，比PBS對照組平均延長了14d，比Ad-mELC治療組延長6.4d。 當小鼠腹腔接種腫瘤第15d后，(即第2次治療結束后3d)，解剖小鼠并收集腹水，計量腹水體積、腫瘤細胞數(shù)和紅細胞數(shù)。MethA腹水模型中，Ad-mELC/PEG治療組和單純Ad-mELC治療組的平均腹水體積為3.2ml和3

8、.3ml，沒有明顯差異(P>0.1)，但與PBS對照組(18.2ml)相比，統(tǒng)計學差異極顯著(P<0.05)；肝癌腹水模型中，Ad-mELC/PEG治療組和單純Ad-mELC治療組的平均腹水體積分別為3.8ml和4.3ml，沒有明顯差異(P>0.1)，與PBS對照組(15.5ml)相比，統(tǒng)計學差異極顯著(P<0.05)。結果表明Ad-mELC和Ad-mELC/PEG治療均明顯抑制了腹水的生長。腹水中紅細胞和腫瘤細胞數(shù)計數(shù)顯示，MethA

9、腹水模型的PBS對照組腹水中的紅細胞數(shù)為264×10<'6>/ml，經(jīng)過Ad-mELC和Ad-mELC/PEG治療的小鼠腹水中紅細胞數(shù)均低于40×10<'6>/ml，比對照組明顯減少(P<0.05)。在肝癌腹水模型中，PBS對照組腹水中的紅細胞數(shù)為244×10<'6>/ml，經(jīng)過Ad-mELC和Ad-mELC/PEG治療的小鼠腹水中紅細胞數(shù)均低于100×10<'6>/ml，比對照組也有明顯減少(P<0.05)。 以MethA腹水

10、模型為例，RT-PCR結果顯示，僅在Ad-mELC和Ad-mELC/PEG治療組小鼠腹水中檢測到mELC表達。Ad-mELC/PEG和Ad-mELC治療組腹水中VEGF的含量為175pg/ml和189.3pg/ml，比PBS對照組(660pg/ml)明顯降低(P<0.05)。腹膜滲透性檢測結果顯示，Ad-mELC/PEG和Ad-mELC治療組腹水的滲透性明顯低于其他對照組(P<0.01)。但是隨治療時間延長，Ad-mELC治療組小鼠腹水

11、中mELC表達量下降，而且與抗腫瘤密切相關的IL12和INF-γ的表達也在下降。相反，在Ad-mELC/PEG治療組中，未檢測到上述三種細胞因子表達下降，而且在第三次治療結束后其表達水平仍高于前兩次治療后測得的表達水平。 綜上所述，本實驗構建了mELC的復制缺陷型重組腺病毒Ad-mELC，并聯(lián)合PEG-liposome治療小鼠惡性腹水，結果顯示聯(lián)合脂質體后，Ad-mELC在早期能明顯抑制腹水生長，在晚期治療中，Ad-mELC對小