EBs-DMOG法對人iPSc向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化作用研究.pdf

1、目的：能夠用于細(xì)胞治療的血管內(nèi)皮細(xì)胞來源有限。為獲得足夠的內(nèi)皮細(xì)胞，本研究探討一種新的促進(jìn)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPSc)向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的方法，即擬胚體（embryoid bodies，EBs）-甲基乙二酰氨基乙酸（Dimethyloxaloylglycine，DMOG）法，獲得足夠的血管內(nèi)皮細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞移植治療心血管疾病奠定基礎(chǔ)。
　　方法：應(yīng)用未分化的人iP

2、Sc，先將其形成EBs，然后用如下6種方法進(jìn)一步誘導(dǎo)促進(jìn)其向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化：A.常氧；B.常氧+血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）（20 mg/ml）；C.常氧+DMOG（0.3mmol/L）；D.缺氧；E.缺氧+VEGF；F.缺氧+DMOG。觀察 iPS-EBs分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，并且用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法及免疫熒光細(xì)胞法檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異基因（CD31，CD

3、34，VE-cad，KDR，vWF）的表達(dá)，以判斷血管內(nèi)皮細(xì)胞分化情況。
　　結(jié)果：1.使用孕12天的昆明小鼠制備原代成纖維（Mouse fibroblasts，MEF）細(xì)胞，傳代培養(yǎng)到第3代后細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素 C去分化處理可以獲得最佳狀態(tài)飼養(yǎng)層細(xì)胞。2.狀態(tài)較好的人 iPSc在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)第7天可見克隆生長，第12天可形成供實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞。3.機(jī)械法劃取iPSc克隆，在低粘附培養(yǎng)板用EBs培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)制備狀態(tài)較好EBs，經(jīng)膠

4、原蛋白鋪板后貼壁培養(yǎng)13天可以誘導(dǎo)生成少量血管內(nèi)皮細(xì)胞。4.iPS-EBs在常氧條件下，添加脯氨酸羥化酶抑制劑（DMOG)顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞特異基因CD31，CD34，VE-cad，KDR，vWF的表達(dá)。在常氧條件下，添加DMOG進(jìn)行誘導(dǎo)分化，是相對合適的誘導(dǎo)分化條件。能成功表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異基因CD31，CD34，VE-cad，KDR，vWF。在細(xì)胞水平，CD31，CD34為膜表達(dá)，KDR、vWF為胞漿表達(dá)。其分化形成的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量