酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人TFF3相互作用蛋白研究.pdf

1、目的：應用酵母雙雜交技術自胃癌細胞cDNA文庫中篩選人TFF3(humantrefoil factor3，hTFF3)相互作用蛋白基因，并以反向酵母雙雜交方法驗證候選結合蛋白。探討hTFF3在胃癌發(fā)生、發(fā)展中可能存在的分子作用機制。 方法：從胃癌細胞系SGC7901中提取總RNA，利用RT-PCR法擴增hTFF3基因，將hTFF3基因定向克隆到酵母表達載體pDEST32，命名pDEST32-hTFF3，Western blot法

2、驗證其在酵母中的表達。酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人胃癌細胞cDNA文庫，提取陽性克隆進行質粒DNA測序，并進行生物信息學分析。根據正向雙雜交篩選結果，將篩選出的醛酮還原酶1C1(AKR1C1)、核不均一核糖核蛋白A1(hnRNP A1)、β-arrestin-1(ARRB1)、伴侶素TCP1-γ(CCTγ)蛋白基因進行PCR擴增，并與hTFF3基因分別定向克隆到pDEST32及pDEST22載體中構建誘餌及獵物質粒。反向酵母雙雜交方法驗證正向篩

3、選結果的可靠性及正確性。 結果：成功以RT-PCR法擴增獲得hTFF3基因，構建pDEST32-hTFF3表達載體。以hTFF3為靶基因經酵母雙雜交實驗自胃癌細胞cDNA文庫中篩選后獲得了21個可能與hTFF3發(fā)生特異性相互作用的陽性克隆，12個克隆成功測序，其中6個陽性克隆的獵物載體內插入基因為已知蛋白基因，分別為醛酮還原酶A1C1、核不均一核糖核蛋白A1、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)α2鏈、伴侶素TCP1-γ、β-arrestin-

4、1、硒蛋白W1，其余6個陽性克隆為未知功能基因。將篩選出的醛酮還原酶A1C1、核不均一核糖核蛋白A1、β-arrestin-1、伴侶素TCP1-γ基因與hTFF3基因進行反向酵母雙雜交，結果證明這四種宿主多肽/蛋白可以與hTFF3發(fā)生相互作用。 結論：篩選并驗證了四種宿主多肽/蛋白可以與hTFF3相互作用，分別為醛酮還原酶A1C1、核不均一核糖核蛋白A1、β-arrestin-1、伴侶素TCP1-γ，為hTFF3與胃癌發(fā)生發(fā)展關