MicroRNA-21負性調(diào)節(jié)Treg cells促進動脈粥樣硬化斑塊進展.pdf

1、第一部分microRNA-21負性調(diào)節(jié)冠心病患者外周血Treg cells促進動脈粥樣硬化斑塊進展
　　目的： Treg cells（regulatory T cells，調(diào)節(jié)性T細胞）在動脈粥樣硬化的發(fā)生于發(fā)展過程中起著重要的保護性作用。最近有研究表明microRNA-21高表達于冠心病患者血清中，并且根據(jù)以往的研究，Treg cells中也發(fā)現(xiàn)有 microRNA-21的表達。因此我們通過本實驗檢測microRNA-21是否參

2、與了動脈粥樣硬化的發(fā)生于發(fā)展，以及其對Treg cells的作用。
　　方法：連續(xù)采集96名華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科住院患者病史資料及靜脈血，根據(jù)患者的臨床診斷將96名患者分成四個組分別為：AMI組（急性心肌梗死組）、UA組（不穩(wěn)定性心絞痛組）、SA組（穩(wěn)定性心絞痛組）和CPS組（胸痛綜合征組）。實時定量PCR檢測各組患者外周血單個核細胞中microRNA-21、Smad7、Foxp3、TGF-β1表達量，分離血清

3、ELISA檢測其中TGF-β1水平，以及流式細胞學檢測 Treg cells比例。并且，分離健康志愿者外周血單個核細胞，細胞轉(zhuǎn)染分別使microRNA-21過表達和去表達，然后觀察上述指標的變化。
　　結(jié)果：隨著冠心病患者疾病的進展，外周血單個核細胞中Treg cells比例逐漸減低，microRNA-21的表達量逐漸升高，其下游靶基因Smad7的表達、Treg cells特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和誘導因子TGF-β1的表達均隨之

4、減低；同時上調(diào)microRNA-21的表達，Treg cells比例降低，Smad7、Foxp3和TGF-β1的表達也降低；相反地抑制microRNA-21的表達，Treg cells比例升高，Smad7、Foxp3和TGF-β1的表達也升高。
　　結(jié)論： microRNA-21隨著冠心病疾病的進展表達增加，并且在這一過程中負性地調(diào)節(jié)Treg cells的比例和功能。
　　第二部分MicroRNA-21表達量隨著ApoE-/

5、-小鼠動脈粥樣硬化的進展逐漸升高
　　目的：炎癥反應是動脈粥樣硬化的一個重要的致病機制，Treg cells（regulatory T cells，調(diào)節(jié)性T細胞）能有效抑制T細胞炎癥反應。microRNA-21被發(fā)現(xiàn)參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，但是它是如何參與動脈粥樣硬化的發(fā)生于發(fā)展的目前仍不明確。本實驗目的是觀察ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中，主動脈中microRAN-21和其靶基因Smad7，以及Treg cells

6、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達。
　　方法：高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，并用近交系C57BL/6J小鼠作為陰性對照組。分別于8周、16周、24周時摘眼球取血處死小鼠，所得的靜脈血離心獲取血漿ELISA檢測不同周齡兩組小鼠 TGF-β1水平。分離心臟，冰凍切片、油紅“0”染色，計算不同周齡小鼠主動脈竇動脈粥樣硬化斑塊的面積。分離小鼠主動脈，實時定量PCR及Western方法動態(tài)觀察不同周齡兩組小鼠主動脈中microRNA-21、Smad7、Fo

7、xp3和TGF-β1的表達水平，流式細胞學方法檢測脾臟單個核細胞中Treg cells的比例。
　　結(jié)果：給予高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-動脈粥樣硬化模型組從第8周，16周到24周均比同周齡的C57BL/6J陰性對照組油紅O染色的動脈粥樣硬化斑塊面積要大；并且ApoE-/-動脈粥樣硬化模型組第8周，16周到24周可以看到逐漸增加的動脈粥樣硬化斑塊。隨著動脈粥樣硬化斑塊的增加，ApoE-/-組Treg cells比例逐漸降低并且明顯

8、低于同周齡的陰性對照組；同時主動脈中microRNA-21的表達則是隨著動脈粥樣硬化斑塊的進展逐漸增加，而其靶基因 Smad7則明顯降低，Treg cells相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3和TGF-β1的表達也明顯降低。
　　第三部分 MicroRNA-21負性調(diào)節(jié)Treg cells不依賴TGF-β1/ Smad途徑
　　目的：在之前的實驗中我們發(fā)現(xiàn)microRNA-21隨著斑塊的進展逐漸升高，并且在此過程中抑制其靶基因Sma

9、d7的表達，同時Treg cells及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子也逐漸降低。但是microRNA-21與其靶基因是否參與了動脈粥樣硬化進展過程中Treg cells及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化仍需進一步的實驗來證實。因此本實驗希望通過細胞轉(zhuǎn)染明確小鼠單個核細胞中microRNA-21對Treg cells的比例和功能的影響，以及其具體的作用機制。
　　方法：分離小鼠脾臟單個核細胞，分別轉(zhuǎn)染microRNA-21 mimic/microRNA-21

10、mimic control和microRNA-21 inhibitor/microRNA-21 inhibitor control，使小鼠脾臟單個核細胞 microRNA-21過表達和去表達，收集轉(zhuǎn)染后細胞 PCR驗證轉(zhuǎn)染后microRNA-21水平，同時PCR和western檢測Smad7、Foxp3和TGF-β1的表達水平，流式細胞學方法檢測 Treg cells比例；同樣適用小鼠脾臟單個核細胞再分別轉(zhuǎn)染Smad7 plasmid/

11、Smad7 plasmid control和Anti-Smad7 siRNA/Anti-Smad7 siRNA control，使小鼠脾臟單個核細胞 Smad7過表達和去表達，收集轉(zhuǎn)然后細胞 PCR和Western驗證轉(zhuǎn)染后Smad7水平和Foxp3表達變化，流式細胞學方法檢測Treg cells比例。
　　結(jié)果： microRNA-21過表達時，脾臟單個核細胞中Treg cells比例和Foxp3表達均降低，Smad7和TGF-

12、β1的表達也明顯降低；相反抑制microRNA-21的表達，細胞中的Treg cells比例和Foxp3表達則增加，單個核細胞中Smad7和TGF-β1的表達也增加。但是通過細胞轉(zhuǎn)染無論是上調(diào)還是下調(diào)脾臟單核細胞中Smad7表達，Treg cells的比例和其特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達無明顯變化。
　　結(jié)論： microRNA-21可以負性調(diào)節(jié)脾臟單個核細胞中的Treg cells，并且microRNA-21對小鼠Treg c