腫瘤抑制基因PTEN過表達對體外培養(yǎng)的人氣道平滑肌細胞增殖的影響.pdf

1、一.研究背景： 氣道重塑是支氣管哮喘基本特征之一，將氣道炎癥和氣道高反應性聯系起來。氣道重塑指的是哮喘中發(fā)生于氣道壁的結構改變，這些改變包括上皮細胞的增生和化生，上皮下纖維化，肌細胞增生和血管發(fā)生。而氣道平滑肌細胞(airwaysmoothmusclecell，ASMC)是氣道重塑的主要結構成分之一。哮喘時ASMC生物學特性發(fā)生很大變化，包括增生，肥大，遷移等，不僅使支氣管對刺激的收縮反應更強烈，加重氣道高反應性，而且增殖的AS

2、MC使氣道壁增厚，導致基礎氣道阻力增加和不可逆性氣流阻塞的發(fā)生。遺憾的是，當前尚無可以阻止或逆轉氣道重塑和其對肺功能影響的有效治療。因此迫切需要深入了解氣道重塑時ASMC的增殖和遷移等機制，尋找抑制其增殖和遷移等的靶點，為尋找新的阻止甚至逆轉氣道重塑的藥物提供理論和實驗依據。 與張力蛋白和輔助蛋白同源，第10號染色體丟失的磷酸酶基因(phophataseandtensinhomologdeletedonchromosone10，

3、PTEN)是近年來發(fā)現的一種新的抑癌基因，是至今發(fā)現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，對細胞的生長、增殖、分化、凋亡、黏附、遷移和血管生長等許多生物學行為有重要影響。隨著研究的深入人們也發(fā)現其在非腫瘤性疾病，如：心肌肥大，高血壓動脈粥樣硬化，支氣管哮喘哮等疾病中也發(fā)揮重要的作用。 已有的研究已經證實PTEN可以通過對P13K，ERK和FAK等通路的抑制來抑制腫瘤細胞，心肌和血管平滑肌等細胞的增殖，而這些通路同時也是介導ASMC增

4、殖，遷移等的主要信號傳導通路，PTEN對ASMC的增殖等是否也有類似地影響，目前尚無相關的報道。我們推斷PTEN的過表達對HASMC可能也具有類似的抑制增殖作用。 二.研究目的： 通過攜帶野生型PTEN全長cDNA的質粒轉染體外培養(yǎng)的人氣道平滑肌細胞(HumanAirwaySmoothMuscleCell，HASMC)，實現PTEN的過表達，以空質粒轉染和正常組作為對照，初步研究PTEN的過表達對HASMC增殖和細胞周期

5、進展的影響。 三.材料和方法： 1、分離肺癌肺葉切除術患者切除的相對正常的肺組織中的小支氣管，按照本實驗室已經成熟的方法培養(yǎng)人氣道平滑肌細胞，4～8代的氣道平滑肌細胞用于實驗。用抗平滑肌a-肌動蛋白單克隆抗體鑒定為人氣道平滑肌細胞。 2、攜帶野生型PTENcDNA的質粒(p-WT-PTEN)和空載質粒(p-EGFP)轉化入大腸埃希菌DH5a中擴增。氨芐青霉素篩選，挑選陽性克隆，搖菌，Omega公司無內毒素質粒提取

6、試劑盒提取質粒，雙酶切，及基因測序鑒定正確后，大量提取質粒，-20℃保存?zhèn)溆谩?3、實驗分組：將細胞分為3組：轉染p-WT-PTEN質粒組(A組)、轉染空載體p-EGFP組(B組)、正常對照組(C組)。參照Lipofectamin2000脂質體轉染試劑盒步驟進行操作，倒置熒光顯微鏡觀察轉染效果。 4、MTS/PMS微量比色法檢測各組HASMC的增殖。 5、各組細胞PI單染后流式細胞儀測定細胞周期分布。 6

7、、Trizol提取總RNA，RT-PCR檢測各組細胞PTENmRNA的表達。 7、免疫組化SP法檢測轉染后各組HASMCPTEN蛋白的表達并拍照。 8、所有原始數據以均數±標準差表示，應用SPSS11.5軟件進行OneWayANOVA(LSD)統(tǒng)計學分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 四.結果： 1、ASMC未匯合之前多呈梭形或多邊形，內有1-2個細胞核，可向細胞密度低的方向伸出一至數個足突。細胞匯合

8、后部分區(qū)域細胞束狀排列，呈典型“峰谷”狀。對平滑肌細胞特異的a-肌動蛋白進行免疫細胞化學染色，免疫反應陽性產物呈棕黃色。傳至第4代，平滑肌純度為95％。 2、少量制備的質粒，經XbaⅠ和HindⅢ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳，可顯示兩條條帶，分子量分別為5.4kb、1.3kb，與pGZdXZ和插入的PTEN基因的大小一致。提取的質粒送北京諾賽公司測序，測序結果經BLAST與Genebank序列完全相符。 3、倒置熒光顯微鏡下，

9、見質粒成功轉染ASMC，轉染陽性細胞在熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光。 4、MTS/PMS法檢測質粒轉染對HASMCs增殖的影響，結果顯示p-WT-PTEN轉染組細胞的吸光度(OD490值)顯著低于p-EGFP轉染組和對照組(P<0.05)；而p-EGFP轉染組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 5、流式細胞儀檢測質粒轉染對HASMCs細胞周期的影響，p-WT-PTEN轉染組G0/G1期細胞的比例顯著大于空載體轉染組與

10、未轉染組，S期及G2/M期細胞的比例顯著少于p-EGFP轉染組與對照組(P<0.05)，p-EGFP轉染組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 6、RT-PCR同時擴增p-WT-PTEN轉染組，p-EGFP轉染組和對照組PTENmRNA，結果顯示p-WT-PTEN轉染組PTENmRNA的表達顯著比p-EGFP轉染組及對照組PTENmRNA的表達增加。 7、轉染48小時各組HASMCPTEN蛋白免疫組化結果顯示，P

11、TEN蛋白在p-WT-PTEN轉染陽性HASMC胞漿和胞核均有明顯表達，且胞核表達比胞漿多，而p-EGFP轉染組和對照組僅見微弱的PTEN蛋白表達。 五.結論： 1、PTEN在HASMC中具有與在其他細胞中類似的抑制增殖的作用，外源PTEN的表達能夠抑制HASMC的增殖和細胞周期進展，G0/G1期細胞的比例增大，而S期及G2/M期細胞的比例減少。 2、p-WT-PTEN成功轉染體外培養(yǎng)地HASMC后，PTEN在m