人源化抗CTLA-4單鏈抗體及其免疫毒素融合蛋白的表達與純化研究：原核大腸桿菌與真核畢赤酵母表達系統(tǒng).pdf

1、細胞毒性T淋巴細胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4，CDl52)是T細胞共刺激受體CD28的結構同源物，通過與抗原提呈細胞上CD28的共同配體CD80/CD86相互作用，而在T細胞反應中起負調節(jié)作用。CTLA4在活化的T細胞和一些腫瘤細胞表面表達，是T細胞活化的良好標志，可以作為免疫抑制劑和腫瘤治療的靶標。 抗CTLA-4單鏈抗體(anti-CTLA4 scFv)具有特異性結

2、合CDl52的活性，在體外和體內是潛在的活化T細胞及腫瘤細胞的靶向分子。在抗CTLA-4單鏈抗體上融合具有特殊功能的效應分子，能起到對靶細胞特異殺傷的作用，從而為實現(xiàn)特異性免疫抑制和腫瘤靶向治療提供可能途徑。 人源化抗CTLA-4單鏈抗體及其相關免疫毒素融合蛋白在生物醫(yī)學實驗研究和免疫系統(tǒng)相關疾病、移植免疫以及腫瘤靶向治療、診斷等領域有著廣闊的應用前景。 本研究以人源化抗CTLA-4單鏈抗體(anti-cTLA4 scF

3、v，簡稱hS)及其相關免疫毒素融合蛋白(hSP，在hS的C端融合了人穿孔素孔道形成結構域的34個氨基酸的融合蛋白)為研究對象。 為了獲得一定量純化的蛋白以深入研究它們的靶向殺傷功能，而先后在原核大腸桿菌和真核畢赤酵母系統(tǒng)表達hS和hSP，進行純化，初步檢測hS蛋白體外結合活性，同時比較它們在兩個系統(tǒng)中的表達情況，為后續(xù)類似蛋白的表達提供模式和借鑒。結果如下： 針對原核大腸桿菌系統(tǒng)表達純化hS和hSP的研究，構建了hS和h

4、SP蛋白在原核大腸桿菌系統(tǒng)的表達質粒pQE-hS、pQE-hSP；并在大腸桿菌M15q中以包涵體形式高表達，表達量占細菌總蛋白的30--54％：建立了hS和hSP包涵體洗滌、純化方法和包涵體復性方法，確定了hS蛋白復性的條件：在4℃，對復性液(50mM Tris-C1 pH 8.0，150mM NaCl，3mM GSH，lmM GSSG，1MUrea)透析復性48小時。hSP蛋白復性條件：在10℃，對復性液(50mM Tris-C1 p

5、H 8.0，20 mM NaCI、0.8 mM KCl、1 mM EDTA、1Murea、0.8 ML-arginine和2mM GSH:0.2 mM GSSG)透析18d小時<'[35]>。純化復性后蛋白的產量：hS，1L培養(yǎng)基產菌體3.866g，洗滌后包涵體1.483g，復性后蛋白28mg;hSP,1L培養(yǎng)基產菌體3.446g,洗滌后包涵體1.216g，復性后蛋白20mg。 本研究構建了hS和hSP在巴斯德畢赤酵母中的表達質

6、粒pPIC9K-hS和pPIC9K-hSP；電穿孔轉化酵母感受態(tài)細胞，用Geneticin濃度梯度平板篩選多拷貝插入重組子；經過小規(guī)模首次甲醇誘導和兩輪表達條件優(yōu)化(甲醇濃度、誘導時間、誘導起始OD600值)，并通過親和純化濃縮目的蛋白。 從1-1.2 L誘導培養(yǎng)基，可獲得的S濃度從0.32mg／ml提高到1.516mg／ml,產量從1.908mg提高到9.505mg；hSP濃度從0.13mg／ml提高到0.505mg／ml

7、，產量從0.95mg提高到2.525mg。但是，可獲得的SP的濃度始終只有S的20％-30％；SP的產量始終只有S的20％-50％。 誘導后，hS的酵母胞內檢測到a-factor-S和S兩種蛋白，hSP胞內只檢測到a-factor-SP，且量不及胞內S蛋白的三分之一。S蛋白的表達水平高于SP蛋白。后續(xù)將考慮繼續(xù)優(yōu)化hSP表達條件，如培養(yǎng)基pH值、降低誘導溫度、考察基因拷貝數(shù)因素等，期望提高SP產量和濃度。 同時，成功

8、構建hSP胞內可溶表達載體pPIC3.5K-hSP，進行hSP胞內表達探索，期望在不存在分泌壓力的情況下，SP蛋白表達量能提高。用間接cell-ELISA方法檢測hS體外結合活性：復性hS和可溶hS蛋白都能特異的結合CTLA4陽性Raji細胞，而對CTLA4陰性ECV-304細胞結合值很低。說明復性hS和可溶hS蛋白具有特異性結合人CTLA-4抗原的能力。 綜合比較原核E．coli和真核Pichia pastoris表達系統(tǒng)，對