大鼠心肌肌漿網(wǎng)鈣-ATP酶啟動子在心肌缺血預(yù)適應(yīng)中的作用及機制.pdf

1、目的：細胞內(nèi)鈣離子濃度變化與心肌缺血-再灌注損傷(IRI)和缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)密切相關(guān)。心肌缺血早期發(fā)生的細胞內(nèi)鈣濃度增高是IPC必不可少的觸發(fā)因素，而維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)是IPC保護作用的重要機制之一。心肌肌漿網(wǎng)鈣-ATP酶(SERCA2a)在心肌細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控中起主要作用，對SERCA2a在IPC過程中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究有可能從基因表達調(diào)控層面揭示SERCA2a在IPC中的作用和機制。藥物誘導(dǎo)預(yù)適應(yīng)作為IPC研究的一個重要內(nèi)容，具有

2、明確的臨床應(yīng)用前景，日益受到重視。故在實驗中我們還探討了前胡丙素誘導(dǎo)預(yù)適應(yīng)的可能作用機制。 方法：1．從大鼠心肌組織中提取基因組DNA作為。PCR 反應(yīng)模板2．設(shè)計并合成合適的引物，用PCR法獲得大鼠SERCA2a啟動子基因片段3．用pGEM-T easy載體連接獲得的啟動子片段，用以轉(zhuǎn)化E．coli Competent Cell JMl09以大量擴增目的片段并送測序鑒定4．選擇合適的核酸內(nèi)切酶剪切SERCA2a啟動子片段，插入

3、到pGL<,3>-Basic載體中構(gòu)建成熒光素酶報道基因質(zhì)粒5．參照美國冷泉港實驗室出版的《細胞實驗指南》上方法進行新生大鼠心肌細胞的分離、純化和培養(yǎng)6．用將心肌細胞置于模擬缺血液中厭氧培養(yǎng)的方法模擬心肌缺血，檢測模擬缺血后LDH漏出量，摸索建立IRI和IPC等細胞模型的合適缺血時間7．用熒光素酶報道基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的心肌細胞，分組后分別建立不同的模型8．裂解各組細胞，加入熒光素酶底物，用SHG-D生物化學發(fā)光測量儀對各組細胞裂解液

4、進行熒光分析。 結(jié)果：成功構(gòu)建了熒光素酶報道基因質(zhì)粒，熒光分析結(jié)果顯示： 1．短暫缺血組熒光素酶活性為陽性對照組的76.68﹪；2．IRI組活性為陽性對照組的26.82﹪；3．IPC組活性為43.13﹪；4．前胡丙素預(yù)適應(yīng)組活性為43.67﹪；5．陰性對照組6.2996。 結(jié)論： 1．SERCA2a基因的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控參與了IPC、IRI等過程，在這些過程中SERCA2a肩動子活性受到嚴重抑制； 2

5、．SERCA2a啟動子對模擬缺血損傷非常敏感，尚不致引起明顯細胞損傷的短暫模擬缺血即可使其活性明顯受到抑制，模擬IRI可以使其活性降至很低的水平； 3．短暫模擬缺血(預(yù)適應(yīng))本身雖然也抑制SERCA2a啟動子的活性，但也能使SERCA2a啟動子對其后發(fā)生的模擬IRI產(chǎn)生耐受，進而可能使得SERCA2a在IRI中的表達相對增加，有利于防止細胞內(nèi)鈣超載，保護IRI細胞； 4．前胡丙素也可以誘導(dǎo)SERCA2a啟動子對IRI產(chǎn)