醛糖還原酶通過自噬調控巨噬細胞固有免疫反應.pdf

1、【研究背景】
　　醛糖還原酶(Aldose reductase,AR)是糖代謝中多元醇通路的限速酶,負責將葡萄糖轉化成山梨醇。但是最近的研究發(fā)現(xiàn),AR的作用并不僅僅局限于糖代謝過程,它還被視為介導多種炎癥性疾病的靶分子。許多實驗證實,AR抑制劑(AR inhib itor,ARI)可以有效地抑制炎癥反應,而過表達AR會增強固有免疫反應。據(jù)報道,AR可能通過NF-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路調控炎癥

2、反應,但是機制尚不明確。
　　經(jīng)典NF-κB信號通路在固有免疫反應中發(fā)揮非常關鍵的作用,通過調控促炎細胞因子轉錄,募集并活化炎癥細胞來執(zhí)行炎癥反應。經(jīng)典N F-κB信號途徑依賴IK Kβ,IK Kβ存在于一個與IK Kα和IK Kγ密切相關的復合體中。炎癥刺激活化IK Kβ,后者使IκBα泛素化降解,最終激活NF-κB信號通路,啟動炎癥相關基因轉錄。
　　自噬(Autophagy)是指胞漿內的雙層膜包裹部分胞質和細胞內需降解

3、的蛋白質、細胞器和病原體等成分形成自噬體(Autophagosome),并與溶酶體融合形成自噬溶酶體(Autolysosome),降解其所包裹的內容物,以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新及清除入侵的病原體。微管相關蛋白輕鏈3(MAP-LC3),包括I型和II型,II型由其前體I型切掉羧基端30個氨基酸后與磷脂酰乙醇胺(PE)連接而形成。LC3 II參與自噬泡膜的成熟過程并分布于膜的兩側,因此,通常把它作為成熟自噬泡的標記物。選擇

4、性自噬是指游離膜結構識別并包裹胞質內的特定底物形成自噬體,并將其降解,比如蛋白聚合物自噬。自噬對蛋白聚合物的降解需要泛素及p62/SQSTM1(Sequestosome1)的參與。p62作為自噬受體,含有泛素相關結構域（Ubiquitin-associated domain,UBA),識別并結合 K63-聚泛素化的底物(K63-polyubiquitinated substrates),然后進一步與泛素樣蛋白(Ubiquitin-lik

5、e protein) LC3結合,從而使底物進入自噬降解途徑。
　　近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬與固有免疫反應有著廣泛的相互調控作用。一方面,固有免疫信號可以誘導或抑制自噬,自噬是固有免疫的重要組成成分,在抗胞內病原體感染中發(fā)揮效應器(Effector)作用,最終通過溶酶體降解被自噬體包裹的病原體。另一方面,自噬也參與眾多固有免疫信號的調控,然而具體的機制依然不清。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn):AR參與脊髓損傷后巨噬/小膠質細胞的

6、極化過程;同時我們體外預實驗發(fā)現(xiàn),LPS誘導的AR缺陷(AR knock-out或者knock-down)巨噬細胞的iNOS表達量較AR正常組低,而自噬水平(LC3 II/LC3 I)較AR正常組高。那么AR,自噬和固有免疫反應這三者之間有著怎樣的聯(lián)系呢?
　　【目的】
　　研究AR,自噬和固有免疫反應之間的相互關系,闡明AR對固有免疫反應的調控機制。
　　【方法】
　　1)培養(yǎng)細胞:野生型(Wide type,

7、WT)和AR敲除型(AR knock-out,AR KO) C57BL/6J小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDMs)和來源于小鼠巨噬細胞瘤的RAW264.7細胞系。
　　2)設計AR siRNA,轉染到RAW264.7細胞,并評價效果。
　　3)體外模擬炎癥反應,提總蛋白,western blot檢測各組經(jīng)典NF-κB信號通路上下游的關鍵分子TLR4,IKKβ,IKKγ,IκBα,p62和iNOS,發(fā)現(xiàn)LPS誘導的AR缺陷(AR

8、 knockout或者knockdown)組IKKβ和IKKγ蛋白水平較AR正常組低。
　　4)提總mRNA,qPC R檢測各組IKKβ和IKKγ mRNA水平,發(fā)現(xiàn)LPS誘導的AR缺陷組IKKβ和IKKγmRNA水平和對照組并沒有差異,說明LPS誘導的AR缺陷巨噬細胞的IK Kβ和IK Kγ蛋白降低發(fā)生在轉錄后水平。
　　5)爬片,免疫組化觀察各組LC3(自噬體Marker)和LAMP1(溶酶體Marker)標記的巨噬細胞

9、,了解AR缺陷對自噬體形成和成熟的影響;提總蛋白,western blot檢測各組LC3和LAMP1蛋白水平;收集細胞,制超薄切片,透射電鏡觀察各組自噬體和自噬溶酶體。
　　6)爬片,免疫組化觀察各組IKKβ、IKKγ分別與LC3和LAMP1的共標情況。
　　7)爬片,免疫組化觀察各組IKKβ、IKKγ分別與泛素(Ub)和p62的共標情況。
　　8)用3-MA阻斷自噬,提總蛋白,western blot檢測各組LC3,

10、IKKβ,IKKγ和iNOS的變化。
　　【結論】
　　1)AR缺陷對固有免疫反應的抑制是由于經(jīng)典NF-κB信號通路中的IKK復合體(IKKβ和IK Kγ)在轉錄后水平被降解;
　　2)AR缺陷可以誘發(fā)自噬體形成,LPS刺激會進一步促進自噬體形成和自噬體成熟;
　　3)LPS誘導的巨噬細胞的IKKβ和IKKγ廣泛地與自噬體和溶酶體結合;
　　4)LPS誘導的巨噬細胞的IKKβ和IKKγ廣泛地泛素化并被p62