骨髓源性多能成體祖細胞向起搏細胞的誘導分化.pdf

1、生物心臟起搏器是心血管領域研究熱點問題。當前構建生物心臟起搏器主要包括基因轉染、細胞移植和組織工程化起搏、傳導組織移植三種方法。基因轉染普遍存在外源基因在體內缺乏長期穩(wěn)定表達、難以有效調控等缺點。細胞移植，組織工程化起搏、傳導組織移植可以避免通過轉染基因建立生物起搏器的缺點。但是，目前在心臟生物起搏器研究中探討的組織細胞(竇房結細胞、幼稚心肌細胞、基因轉染的心肌細胞等)、胚胎干細胞、間充質干細胞，均有其目前無法克服的弊端，尋找新的種子細

2、胞，是心臟生物起搏器研究的當務之急。本研究擬采用條件培養(yǎng)、與起搏細胞聯(lián)合培養(yǎng)等方法，探討將骨髓多能成體祖細胞誘導分化為起搏細胞的可能性，旨在為心臟生物起搏器的構建提供一種來源豐富、無排斥反應、活性好的種子細胞。研究發(fā)現(xiàn)，5-氮雜胞苷+內皮素-1、竇房結細胞培養(yǎng)液等條件培養(yǎng)可使MAPCs表達起搏離子通道，與竇房結細胞共培養(yǎng)能將MAPCs誘導分化為起搏樣細胞；該細胞體外具有驅動心肌跳動的起搏活性。
　　 研究目的：
　　 病

3、態(tài)竇房結綜合癥、房室傳導阻滯等緩慢型心率失常嚴重威脅人類健康，而電子起搏器存在諸多問題，制約了它的應用。生物心臟起搏理論上可以克服電子起搏器的缺陷，有很好的臨床應用前景。
　　 當前構建生物心臟起搏器主要包括基因轉染、細胞移植和組織工程化竇房結、房室結、傳導束移植三種方法。基因轉染普遍存在外源基因在體內缺乏長期穩(wěn)定表達、難以有效調控；缺乏高效、安全、導向性好的載體系統(tǒng)等缺點。細胞移植建立心臟生物起搏器可以避免應用基因轉染方法建立

4、生物起搏器的缺點，而組織工程化竇房結、房室結、傳導束的構建將心臟生物起搏器的研究提高到組織、器官水平。然而，目前在心臟生物起搏器研究中涉及細胞包括：組織細胞(竇房結細胞、幼稚心肌細胞、基因轉染的心肌細胞等)，存在著對移植部位微環(huán)境適應能力差及供體來源困難等問題；胚胎干細胞，有報道表明胚胎干細胞分化的自發(fā)跳動的心肌細胞移植到心臟后可以發(fā)揮起搏功能，并對神經(jīng)性調節(jié)有反應，但是胚胎干細胞具有向終末細胞分化的特性，而分化的終末細胞則失去起搏特性

5、，精確控制其分化方向尚難解決，以及免疫排斥反應問題；間充質干細胞，雖然在體外能夠將間充質干細胞誘導分化為具有起搏電流的細胞，但間充質干細胞并沒有特異的起搏離子通道，單一的起搏電流(If)能否持久維持起搏功能，尚缺乏實驗依據(jù)，因此，一般認為，間充質干細胞誘導來的具有起搏功能的細胞在體內并不能替代起搏細胞，僅作為攜帶起搏基因的載體?？梢姡瑢ふ倚碌姆N子細胞，是心臟生物起搏器研究的當務之急。
　　 骨髓源性多能成體祖細胞(multipo

6、tent adult progenitor cells，MAPCs)，可來源自體、取材方便、活性好、分化增殖能力強，如能誘導分化為起搏細胞則可以將心臟生物起搏器的研究推進到可臨床應用的層面，然而，目前尚無MAPCs向起搏細胞誘導分化的報道。
　　 本研究擬采用條件培養(yǎng)、與起搏細胞聯(lián)合培養(yǎng)等方法，探討將MAPCs誘導分化為起搏細胞的可能性，旨在為心臟生物起搏器的構建提供一種來源豐富、無排斥反應、活性好的種子細胞。
　　 第

7、一部分MAPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 研究目的:進行MAPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定，獲取可用于向起搏細胞誘導分化的種子細胞。
　　 材料與方法:全骨髓培養(yǎng)法、MAPCs專用培養(yǎng)基培養(yǎng)1月齡大鼠脛骨和股骨骨髓。培養(yǎng)1個月后，經(jīng)免疫磁珠法分選CD45陰性細胞，克隆培養(yǎng)并擴增。經(jīng)鼠SSEA-1多克隆抗體流式細胞檢測陽性細胞百分比，Oct-4、SSEA-4、CD44、CD45、CD133、MHCⅡ免疫熒光檢測細胞表面標志，并經(jīng)

8、Western Blot分析Oct-4蛋白的表達。
　　 結果:培養(yǎng)的MAPCs細胞呈長梭形，細胞潛伏期短，24h后已經(jīng)開始增殖，倍增時間為2d。蛋白表達Oct-4+、SSEA-4+、CD44-、CD45-、CD133-、MHCⅡ-，流式細胞技術檢測SSEA-1陽性細胞為86.41％。
　　 結論:成功分離培養(yǎng)了MAPCs。
　　 第二部分條件培養(yǎng)基對MAPCs的誘導分化
　　 研究目的:分別采用5-氮雜

9、胞苷+內皮素-1、竇房結細胞培養(yǎng)液誘導MAPCs，探討條件培養(yǎng)基將MAPCs誘導分化為起搏細胞的可能性。
　　 材料與方法:分別用10mmol/L的5-氮雜胞苷結合10-8M的內皮素-1和竇房結細胞培養(yǎng)后的培養(yǎng)液誘導5～10代MAPCs。免疫熒光檢測α-SMA、mlv2α、HCN2、HCN4蛋白表達；real-time PCR檢測HCN1、HCN2、HCN4等基因的表達。
　　 結果:5-氮胞苷與ET-1聯(lián)合使用的方法誘

10、導MAPCs，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞變大，多數(shù)呈大三角形。誘導后細胞表達心肌細胞標志物α-SMA、mlv2α，編碼起搏電流If的HCN2、HCN4，多能性干細胞標志物Oct-4和SSEA-4不再表達。竇房結細胞培養(yǎng)液誘導MAPCs后細胞同樣變大，但突起較少，基本還保持長梭形；竇房結細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后的細胞HCN2、HCN4免疫熒光染色表達陽性，而Connexin43和TnT則基本不表達；real-time PCR檢測HCN2、HCN4

11、、Cav1.2、ERG、KvLQT1、MiRP1基因表達，但是遠低于培養(yǎng)的竇房結中的表達水平。
　　 結論:條件培養(yǎng)不能將MAPCs誘導分化為典型的起搏細胞，但具備起搏離子通道。
　　 第三部分竇房結細胞共培養(yǎng)對MAPCs的誘導分化
　　 研究目的:通過MAPCs與竇房結細胞共培養(yǎng)的研究，探討共培養(yǎng)將MAPCs誘導分化為起搏細胞的可能性。
　　 材料與方法:首先將差速貼壁結合BrdU培養(yǎng)的新生大鼠竇房結細

12、胞接種于6孔板上，然后將MAPCs第5代細胞加入Transwell小室，密度為每孔1×104個細胞。將種植細胞的Transwell小室插入6孔板中，在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在共培養(yǎng)1周、2周、3周和4周后，免疫熒光化學、real-time PCR檢測相關分子的表達。
　　 結果:共培養(yǎng)后，與條件培養(yǎng)類似，細胞變大，但突起較少，基本還保持長梭形。相關標志物HCN4、Connexin40和Connexin45免疫熒光染色

13、表達陽性，HCN2表達弱，而Connexin43和TnT則基本不表達；real-time PCR檢測HCN2、HCN4、Cav1.2、ERG、KvLQT1、MiRP1基因表達，表達高于條件培養(yǎng)組而低于培養(yǎng)的竇房結。隨培養(yǎng)時間的延長mRNA略有增加，但3周后就基本達平臺期。Cav3.1、Kir2.1基因的表達少或基本不表達。
　　 結論:與竇房結細胞共培養(yǎng)不能將MAPCs誘導分化為典型的具有自發(fā)搏動活性的起搏細胞，但與條件培養(yǎng)基誘

14、導分化相比，更接近起搏細胞，我們暫稱之為起搏樣細胞。
　　 第四部分起搏樣細胞起搏功能的體外檢測
　　 研究目的:將與竇房結細胞共培養(yǎng)2周獲得的起搏樣細胞，種植在靜息的新生大鼠心肌細胞單層上，觀察細胞搏動情況，探討該細胞對心肌的起搏作用。
　　 材料與方法:將與竇房結細胞共培養(yǎng)2周獲得的起搏樣細胞，種植于靜息的新生大鼠心肌單層上，觀察細胞搏動情況。分別加入1×10-7mol/1異丙腎上腺素和先加入1×10-6mo