一種鼠源抗CTLA4單鏈抗體mS的構(gòu)建及制備.pdf

1、免疫抑制劑在臨床上的廣泛應用是二十世紀器官移植領(lǐng)域取得的重大突破性進展之一。免疫抑制劑的廣泛應用在大規(guī)模降低急性排斥反應發(fā)生率的同時，也引起了長期蓄積的毒副作用，從而導致移植器官的損傷，制約了病人或供器官長期存活率的進一步提高。已有研究表明，活化T細胞是介導移植排斥的重要細胞，選擇性清除活化T細胞而保留靜息T細胞，能控制移植排斥反應發(fā)生，減少藥物的毒副作用。 活化的 T 細胞表面會誘導表達細胞毒性 T 淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTL

2、A4)分子，基于識別CTLA4分子而殺傷活化 T 細胞的免疫毒素可以特異性殺傷活化T細胞而保留靜息T細胞。作為免疫毒素關(guān)鍵的導向分子決定著目標分子的識別，詳細探討導向分子的功能對構(gòu)建免疫毒素非常必要。基于此，本文設(shè)計鼠源anti-cTLA-4單鏈抗體(scFv)(簡稱mS)，用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達該單鏈抗體，初步探索其功能，結(jié)果如下： 以裝載了鼠源Anti-cTLA-4-scFv基因的PBMN質(zhì)粒為模板，根據(jù)鼠源Anti-CTL

3、A-4-scFv的基因序列設(shè)計引物，在引物設(shè)計時引入相關(guān)雙酶切位點(BamtI/Kpn I)，PCR擴增獲得單鏈抗體基因，再克隆到pQE30載體，提取pQE30-mS質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達，提取表達產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)蛋白mS絕大部分以包涵體形式表達，占細菌總蛋白量30％，極少量以可溶分子形式存在?？扇懿糠纸?jīng)親和層析純化后，純度僅能達到50[％]且表達量僅為mS總蛋白量的1[％]。包涵體經(jīng)洗滌緩沖液洗滌后，純度可達75[％]。洗滌后包涵體經(jīng)8mo

4、l／L尿素溶解，變性條件pH值7.5下DEAE柱層析吸附雜蛋白，mS純度提高到95％以上。 經(jīng)純化后變性mS在復性緩沖液(50mmol／L Tris，pH8.0，20mmol／lNaCI,0.8mmol/L KCI，lmmol/L EDTA，2mmol/L GSH，0.2mmol/LGSSH，1mol/LUrea，0.8mol/LL-Arginine)中4℃透析復性48h，獲得可溶蛋白。 以人臍靜脈細胞株ECV-304為

5、陰性對照細胞，以小鼠淋巴瘤細胞株EL4為陽性對照建立細胞模型，檢測復性后可溶mS功能。以Hanks buffer為空白對照，間接細胞ELISA法測定mS與細胞的結(jié)合活性。結(jié)果顯示mS具有高特異性，具有與CTLA-4陽性細胞EL4細胞特異性結(jié)合的功能，結(jié)合率是陰性細胞ECV-304細胞的3倍。 本論文的研究表明，成功構(gòu)建、表達的鼠源抗CTLA4單鏈抗體分子mS具有高特異性，能特異性結(jié)合CTLA-4陽性表達細胞。基于此項研究結(jié)果，后