急慢性酒精中毒大鼠凝血功能變化與外傷性蛛網膜下腔出血發(fā)生及死亡機制研究.pdf

1、1. 背景及目的:
　　 酗酒是嚴重的社會公害之一，過度飲酒造成的酒精中毒已成為獨立的、不容忽視的致死因素。在法醫(yī)學鑒定中，經常遇見飲酒后較輕微頭頸部外傷引發(fā)的外傷性蛛網膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage, TSAH)，其發(fā)生率約占TSAH的87%，死亡率達50%以上。由于目前對酒精和外力因素在TSAH發(fā)生及死亡機制中相互關系和作用程度大小尚無統(tǒng)一認識，致使此類案件的鑒定往往爭議較大

2、，亦給法庭審判量刑帶來困難。因此，有必要深入研究酒后TSAH的發(fā)生及死亡機制，明確各因素在傷亡后果中的參與度，為此類案件法醫(yī)學鑒定及審判量刑工作提供必要的科學證據和理論參考。
　　 本研究通過建立急慢性酒精中毒大鼠打擊模型，檢測不同時相點大鼠血乙醇濃度、凝血功能及抗凝活性變化系列指標，觀察各指標變化的內在聯(lián)系，從血液的酒精毒理學角度探討急慢性酒精中毒大鼠TSAH發(fā)生機制。同時，檢測血栓烷A-2 及其受體表達并監(jiān)測心功能變化，從腦

3、-心聯(lián)系角度探討急慢性酒精中毒大鼠TSAH死亡機制。
　　 2. 材料與方法：
　　 2.1 動物分組與模型建立
　　 SPF 級成年雄性SD 大鼠90 只，體重300±50g。實驗動物分組見下表。實驗大鼠灌胃和打擊處置后觀察0.5h，乙醚麻醉，腹主動脈采血并放血處死，立即開顱觀察并記錄TSAH發(fā)生率及出血量情況，留取腦、心、肝等組織凍存及固定處理。
　　 2.2 實驗方法
　　 觀察實驗大鼠的行

4、為學、體重、血壓、心電變化及腦組織病理學改變；氣相色譜法檢測血乙醇濃度(BAC)；全自動凝血分析儀檢測凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)及纖維蛋白原(FIB)；全自動血氣分析儀檢測pH 值、血氧飽和度(SaO2)、氧分壓(PO2)、碳酸氫根(HCO3 - )、剩余堿(BE)等7 項血氣分析指標；ELISA法檢測血漿中組織因子(TF)、組織因子途徑抑制劑(TFPI)、組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、

5、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1)、D 二聚體(D-D)及血栓烷B-2（TXB-2)濃度；免疫組化法及免疫印跡法進行定性、定位及定量檢測腦及心組織的tPA、TXA2R 表達情況。
　　 統(tǒng)計TSAH發(fā)生率及死亡率，F(xiàn)isher 法分級TSAH。所有實驗數(shù)據均采用SPSS 17.0 及Excel 2007 進行統(tǒng)計學處理和分析。
　　 3. 結果:
　　 3.1 行為學表現(xiàn)及體重、血壓變化
　　 急性灌

6、酒組大鼠酒后0.5h 內興奮性增強，此后逐漸出現(xiàn)昏睡、翻正反射消失等急性酒精中毒表現(xiàn)，4-6h后逐漸清醒。慢性灌酒組大鼠每次灌酒后均有急性酒精中毒表現(xiàn)，灌酒1 周后體重明顯下降，至第4 周末下降達60g 以上(p<0.01)。第3 周始尾動脈壓自16.60 ±0.76 kPa 升高至17.48 ±0.90 kPa（p<0.05)。打擊后，實驗組大鼠均呈典型的腦震蕩表現(xiàn)，AA/AW/CW 及部分CA 組大鼠3-5sec后漸至正常，55%(

7、11/20)CA 組大鼠出現(xiàn)角膜反射消失、四肢抽搐、口唇發(fā)紺、呼吸由深大轉至淺慢，2-4min 內迅速死亡。
　　 3.2 心電變化
　　 腦震蕩性打擊后，各實驗組均出現(xiàn)一過性心電基線漂移，心率從正常的400 bpm 增至500-600 bpm，約5-6sec后漸至正常，而慢性灌酒組死亡大鼠在心電恢復正常后30-60sec 內，心率驟減至100-200 bpm 伴心律不齊，而后逐漸減慢，直至消失，心電呈直線改變，此過程歷

8、時約2-4min。
　　 3.3 腦組織病理學觀察和TSAH發(fā)生率及死亡率
　　 急性灌酒組傷后腦組織輕度淤血、腫脹，多數(shù)有少量蛛網膜下腔出血，局限于腦干腹側面或小腦表面，腦神經元及膠質細胞輕度水變性。慢性灌酒組傷后腦組織中至重度淤血、腫脹，多數(shù)有較多量蛛網膜下腔出血，廣泛分布于全腦，腦神經元及膠質細胞水變性，可見噬神經和衛(wèi)星現(xiàn)象；小腦蒲肯野細胞排列疏密不均，部分溶解消失；腦干神經核團多見“暗神經元”，呈深暗紅色、胞體皺

9、縮、胞漿及胞核濃縮、均質化、核不清或消失、軸突不規(guī)則扭曲等表現(xiàn)。急慢性組腦實質內均未見明顯挫傷及出血改變。
　　 急慢性灌酒組TSAH發(fā)生率分別為26%及85%（p<0.01)，死亡率分別為0 及55%(p<0.01)，且死亡大鼠均發(fā)生TSAH。
　　 3.4 血乙醇濃度變化
　　 灌酒后2h 大鼠BAC 達峰值188.16±14.71 mg/dL，0.5h 至4h 始終處于人醉酒下限值80 mg/dL 之上，6

10、h后仍達60.08±13.80 mg/dL。
　　 3.5 凝血功能變化及與BAC、TSAH的相關性分析
　　 急性灌酒組各時相點血漿中PT、TT、APTT 均不同程度延長，2h 最明顯，分別達28.50±2.08、35.49±1.15、24.56±1.09 sec（p<0.01)；FIB 先升高(0.5h，p<0.05)后下降(1h，p<0.05)再緩慢回升趨于正常。慢性灌酒組各指標亦不同程度延長和增高，與相應對照組(

11、Control/CW)比較差異顯著(p<0.05)，但與AA-2h 組比較差異不明顯(p>0.05)。急性灌酒組PT、TT 及APTT與BAC 存在較強的相關性(分別r=0.789，0.818，0.752)，呈正相關線性分布；FIB與BAC 二者相關性不明顯(p>0.05)。急性灌酒組各時相點TSAH發(fā)生率與對應的BAC 存在高度正相關(r=0.974)，決定系數(shù)R 2=0.949。
　　 3.6 血氣分析變化
　　 急

12、性灌酒組動脈血pH 值、SaO2、PO2、HCO3 -、BE 均不同程度降低，2h 達最低點(分別為7.26±0.05、97.77±0.36、12.70±3.67、14.17±0.95、-12.57±2.90)(p<0.05)，此后緩慢回升，部分指標至6h 仍未恢復正常范圍。慢性灌酒組亦有不同程度降低，與相應對照組比較均有顯著差異(p<0.05)，急慢性灌酒組間差異不顯著(p>0.05)。
　　 3.7 血漿TF/TFPI、tP

13、A/PAI-1、D-D 及TXB-2 濃度變化
　　 急性灌酒組各時相點TF 不同程度降低，2h 達最低點385.32 ±104.13 pg/ml（p<0.01)，TFPI 不同程度升高，2h 達峰值1611.65 ±211.59 pg/ml（p<0.01)；TF/TFPI 先降后升，2h達最小值0.2391。慢性灌酒組二者與相應對照組及AA-2h 組比較差異顯著(p<0.05)。
　　 急性灌酒組各時相點tPA 及PA

14、I-1 均不同程度升高，2h分別達峰值6422.18 ±119.76pg/ml（p<0.01)及21246.67 ±1346.07 pg/ml（p<0.01)，tPA/PAI-1 先升后降，2h 達最大0.3023。慢性灌酒組tPA 及PAI-1與相應對照組及AA-2h 組比較差異亦顯著(p<0.05)。
　　 急性灌酒組各時相點D-D 不同程度升高，0.5h-6h與相應對照組比較差異顯著(p<0.05)，2h 達峰值2207.

15、40 ±322.12 pg/ml（p<0.01)。慢性灌酒組D-D與相應對照組及AA-2h 組比較有顯著差異(p<0.05)。
　　 急性灌酒組各時相點TXB-2 略升高，1h與相應對照組差異顯著(p<0.05)。慢性灌酒組TXB-2 明顯升高，與相應對照組及急性灌酒組比較均有高度顯著差異(p<0.01)。
　　 3.8 腦及心組織tPA/TXA2R 表達變化
　　 目的蛋白tPA 在各組額葉、小腦、腦干延髓腹側

16、及背側面的免疫印跡膜67kDa 處均出現(xiàn)清晰條帶。三個對照組條帶較窄細、色淡，急慢性灌酒組條帶較粗深。IHC 光密度分析結果顯示，急性灌酒組tPA 表達均明顯增加，與相應對照組差異高度顯著(p<0.01)，2h表達最強，IOD 值分別為65975.29±5961.34、70203.96±5406.58、64696.20±6394.44 及68072.76±4471.79。慢性灌酒組tPA 表達亦增強，與相應對照組差異亦高度顯著(p<0.

17、01)，與AA-2h 組比較，除額葉外，其余部位tPA 表達量均有顯著差異(p<0.05)。
　　 目的蛋白TXA2R 在腦干及心組織的免疫印跡膜58kDa 處均出現(xiàn)較清晰條帶，但是腦(除慢性灌酒組)及心的各實驗組條帶均較窄細，其中慢性灌酒組條帶粗深，其IOD 值達6188.04 ±391.11，與相應對照組、急性灌酒組以及同組的心臟差異均高度顯著(p<0.01)。
　　 4. 結論:
　　 （1)BAC與凝血功

18、能、TSAH三者間存在明顯的劑量-效應關系：BAC 越高，凝血時間越長，TSAH發(fā)生率就越高；酗酒時間越長，凝血功能破壞越嚴重，TSAH發(fā)生率及死亡率就越高。
　　 （2)急慢性酒精中毒均可抑制TF/TFPI的凝血啟動機制、增強tPA/PAI-1的纖溶激活作用，破壞二者動態(tài)平衡，降低凝血功能，長期酗酒更顯著，成為酒后TSAH高發(fā)生率的重要機制之一。
　　 （3)急慢性酒精中毒導致的機體持續(xù)低氧狀態(tài)，可促進血管內皮tPA