重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的人核心蛋白聚糖基因逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的研究.pdf

1、研究背景和目的：纖維增生性疾病是導(dǎo)致死亡率和發(fā)病率升高的一個重要因素，同時它也影響著所有組織，器官和系統(tǒng)的功能。然而，盡管此類疾病給人們的健康造成極大的威脅，目前卻沒有有效的能針對纖維化發(fā)生機制的治療方式。纖維化通常被定義為機體對于創(chuàng)傷-愈合反應(yīng)失調(diào)控，是心臟及其它組織對于損傷的一種反應(yīng)性應(yīng)答。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一種成纖維細胞趨化因子，可以刺激成纖維細胞增殖，增加細

2、胞外基質(zhì)蛋白（包括膠原）的合成。大量研究證明TGF-β在心肌纖維化的病因及進展中扮演重要角色。因此我們希望能找到可以阻斷TGF-β生物學(xué)活性的一種特異性物質(zhì)，而人核心蛋白聚糖(decorin，DCN)正是這樣一種物質(zhì)。DCN屬于小蛋白聚糖家族中的一員，其特點是核心蛋白富含亮氨酸的重復(fù)單位。人核心蛋白聚糖被認為是TGF-β的一種天然的拮抗因子。大量實驗證明DCN不僅能結(jié)合TGF-β，而且可以通過對TGF-β的生物學(xué)活性進行中和而抑制因TG

3、F-β過度表達而引發(fā)的各個器官纖維化。隨著對DCN功能和組成結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，表明DCN在因過度表達TGF-β而導(dǎo)致的器官纖維化的防治中有著廣泛的應(yīng)用前景。因此我們推測DCN可能為高血壓所致的心血管系統(tǒng)器官纖維化的治療研究提供新的靶點。近年來，重組腺相關(guān)病毒載體(recombinant adeno-associated virus，rAAV)得到了廣泛的研究和關(guān)注。rAAV能轉(zhuǎn)染非分裂期和分裂期細胞，并且可以獲得較為穩(wěn)定，高效和長久的

4、表達。基于上述理論基礎(chǔ)，本研究克隆人DCN基因cDNA全長序列，測序鑒定正確后將其連接到重組腺相關(guān)病毒載體上，并在293細胞中進行病毒包裝，且經(jīng)過斑點雜交實驗測定其滴度，最終收獲能夠滿足我們實驗所需要的高滴度的重組腺相關(guān)病毒DCN (rAAV-DCN)。然后經(jīng)大鼠尾靜脈轉(zhuǎn)染到老年自發(fā)性高血壓大鼠纖維化模型中，觀察重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的DCN基因?qū)ψ园l(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的治療作用及進一步對其相關(guān)機制進行研究。
　　 方法：將人類

5、DCN基因?qū)胫亟M腺相關(guān)病毒載體中，并在293細胞中進行病毒包裝，且經(jīng)過斑點雜交實驗測定其滴度，最終收獲能夠滿足我們實驗所需要的高滴度的重組腺相關(guān)病毒DCN (rAAV-DCN)。然后以已經(jīng)發(fā)生心肌纖維化的四個月月齡的自發(fā)性高血壓大鼠為模型，分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水1ml，rAAV-GFP和rAAV-DCN病毒（1′1011pfu/只，每組7只），在實驗前及導(dǎo)入病毒后每2周監(jiān)測一次動脈收縮壓并收集一次24小時尿，共持續(xù)4個月。處死動物前

6、經(jīng)右頸總動脈插管入左心室，用美國PowerLab公司提供的心功能測定儀測定大鼠心功能的各項指標。處死動物之后提取動物心、主動脈、肝、腎等組織并置入-80℃冰箱中保存，然后提取上述組織中的總RNA和蛋白質(zhì)。接著分別用RT-PCR，Western blot和ELISA方法檢測DCN mRNA和蛋白質(zhì)的表達和分布情況；檢測不同時間段尿中微量白蛋白的含量及變化；全心及左心室稱重以了解心室重構(gòu)情況；腎臟，心臟石蠟包埋后用膠原染色并進行定量分析以觀

7、察腎臟和心臟纖維化情況。同時用Western blot檢測TGF-β、α-SMA、p-smad2、p38MAPK和p-Akt等信號途徑。
　　 結(jié)果：1.心功能分析檢測表明，導(dǎo)入DCN基因后可使心功能得到明顯的改善，rAAV-DCN組大鼠左室收縮末壓(LVESP)，左室等容收縮壓最大上升速率（+dp/dtmax）和左室等容舒張壓最大下降速率(-dp/dtmax)的絕對值較對照組和GFP組顯著增加，而左室舒張末壓(LVEDP)顯著

8、降低；2.Western blot檢測發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入rAAV-DCN病毒后，在心臟、肝臟和腎臟中DCN基因均有顯著的表達，同時RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入rAAV-DCN病毒后，在心臟、肝臟、腎臟和血管中均有DCN基因顯著表達，除此之外，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入了rAAV-DCN病毒的動物從第2周開始直到實驗終點（16周），其血漿中的DCN水平均有較高且穩(wěn)定的表達，且其表達水平要顯著高于對照組；3.心臟切片的膠原染色分析結(jié)果顯示：用天狼星紅染色法對

9、心肌進行膠原染色后可見對照組及GFP組心肌細胞肥大，心肌排列紊亂且可見大量膠原沉積，而導(dǎo)入了rAAV-DCN病毒的動物其心肌結(jié)構(gòu)較為正常且僅見少量膠原沉積。這說明DCN可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)高血壓引起的心肌重構(gòu)；4. 心肌細胞直徑測量及左心室重量與心臟重量的比值也證實了以上結(jié)果；5. 導(dǎo)入DCN基因后的不同時間點，尿微量白蛋白的含量較對照組要明顯下降，且此種作用一直持續(xù)到實驗終點（16周）；6.腎臟天狼星紅染色表明：對照組及GFP組可見腎臟腎小

10、球纖維化程度明顯，血管壁增厚且有大量紅色膠原沉積。而DCN組較為正常，僅見少量紅色膠原沉積沉積。這表明DCN可預(yù)防或明顯改善老年高血壓大鼠的腎臟纖維化；7.Western blot結(jié)果顯示導(dǎo)入DCN基因后α-SMA的表達水平較對照組和GFP組顯著降低；8.Western blot結(jié)果顯示導(dǎo)入DCN基因后TGF-β、p-smad2、p38MAPK的表達水平較對照組和GFP組顯著降低，而Smad6及P308-Akt的表達水平較對照組和GFP