尾加壓素Ⅱ?qū)Ψ蝿用}平滑肌細胞膠原合成的影響及其細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 肺動脈高壓是各種原因引起的靜息狀態(tài)下右心導管測得的肺動脈平均壓(meanpulmonaryarterialpressuremPAP)≥25mmHg的一組臨床病理生理綜合癥。先天性心臟病是小兒最常見的心臟病，在1000個出生存活嬰兒中，發(fā)生本病者約6～8名，中國每年大約有15萬新生嬰兒患有各種類型的先天性心臟病(congenitalheartdisease，CHD)，而肺動脈高壓是CHD常見且嚴重的并發(fā)癥。

2、房間隔缺損(atrialseptaldefect，ASD)、室間隔缺損(ventricularseptaldefect，VSD)及動脈導管未閉(patentductusarteriosus，PDA)是兒童常見左向右分流型CHD，隨著病情進展，肺循環(huán)血流量持續(xù)增加，逐漸形成肺動脈高壓，發(fā)展成為艾森曼格(Eisenmenger)綜合癥，伴有肺動脈高壓的CHD患者手術(shù)風險性及死亡率明顯增加，甚至失去手術(shù)機會。目前對肺動脈高壓尚無有效的治療方法

3、。肺動脈高壓的特征性病理改變?yōu)榉窝苁湛s反應(yīng)增強及肺血管結(jié)構(gòu)重建。肺血管收縮反應(yīng)增強屬功能性改變，是可逆的;肺血管結(jié)構(gòu)重建是肺動脈平滑肌細胞肥大、增殖及膠原等細胞外間質(zhì)沉積引起肺血管管壁增厚，管腔狹窄，屬結(jié)構(gòu)性改變，是不可逆的。
　　 近二十多年來，UⅡ(UrotensinⅡ，UⅡ)從1985年自硬骨魚尾垂腺中分離出到如今作為人類心血管疾病病理生理過程中的一種重要調(diào)節(jié)因子而被廣泛關(guān)注。研究證實體內(nèi)一種孤立的G蛋白藕聯(lián)受體—GPR

4、14是UⅡ的特異性受體(UT)，UⅡ及其受體廣泛分布于人體的心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、胰腺等多種組織。UⅡ與UT結(jié)合，能夠引起一系列生物學效應(yīng)，包括血管收縮，促血管平滑肌細胞、成纖維細胞及癌細胞的增殖及細胞的遷移等。UⅡ在肺動脈高壓形成過程中起重要作用，且目前已發(fā)現(xiàn)UT受體特異性抑制劑Urantide，可以拮抗UⅡ的上述作用。但UⅡ及其受體拮抗劑Urantide對培養(yǎng)的Wistar大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖及其對肺動脈平滑肌細胞Ⅰ、

5、Ⅲ型膠原合成的影響尚未見報道，UⅡ及其受體拮抗劑Urantide調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細胞膠原合成的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制尚未見報道。
　　 本研究的目的:
　　 研究尾加壓素Ⅱ(UrotensinⅡ，UⅡ)及其受體拮抗劑Urantide對培養(yǎng)的大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原(collagenⅠ、Ⅲ)合成的影響，探討細胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑(extracellularsignal-regulatedkinas

6、e1/2，ERK1/2)是否參與了促肺動脈平滑肌細胞增殖及膠原合成增加過程。為Urantide通過阻止UⅡ的促增殖作用來實現(xiàn)其延緩肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的說法提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.動物選擇:取120g左右健康雄性Wistar大鼠，行肺動脈平滑肌細胞分離并進行原代培養(yǎng)，經(jīng)Rabbitanti-α-actin單克隆抗體及FITC免疫熒光進行細胞鑒定。
　　 2.肺動脈平滑肌細胞原代培養(yǎng):以組織貼塊法培養(yǎng)

7、的大鼠PASMCs為研究對象，分為不同實驗組:①UⅡ作用組:將不同濃度(10-10mol/L～10-7mol/L)UⅡ加入細胞培養(yǎng)孔，（每個濃度n=5），觀察UⅡ?qū)ASMCs增殖的影響;②Urantide阻斷組:10-7mol/LUrantide作用30min后加入10-7mol/LUⅡ繼續(xù)作用24h(n=5)，觀察Urantide對UⅡ的拮抗作用;③PD98059抑制組:10-5mol/LPD98059作用30min后加入10-7m

8、ol/LUⅡ繼續(xù)作用2h(n=5)，觀察PD98059對磷酸化ERK1/2的抑制作用;④對照組:未加入UⅡ及其受體拮抗劑(n=5)。
　　 3.培養(yǎng)PASMCs增殖:采用CCK-8法及BrdU摻入實驗測定UⅡ及Urantide對培養(yǎng)大鼠PASMCs增殖的影響。
　　 4.實時定量PCR檢測UⅡ及Urantide對肺動脈平滑肌細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原及p-ERK1/2基因表達的影響，同時測定PD98059對p-ERK1/2基因表達

9、的影響。
　　 5.Westernblotting測定UⅡ及Urantide對培養(yǎng)大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ膠原及磷酸化ERK1/2蛋白表達的影響，同時檢測PD98059對磷酸化ERK1/2蛋白表達的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.本研究通過組織貼塊法成功原代培養(yǎng)出肺動脈平滑肌細胞，經(jīng)Rabbitanti-α-actin單克隆抗體及FITC免疫熒光對培養(yǎng)的細胞進行鑒定，其純度達95％。
　　 2.CCK-8細

10、胞生長測定及BrdU摻入實驗結(jié)果顯示:不同濃度的UⅡ(10-9mol/L～10-7mol/L)可濃度依賴性地促進PASMCs的增殖(P＜0.05，P＜0.001)，其中UⅡ(10-7mol/L)，促增殖作用最明顯(P＜0.001);UⅡ(10-10mol/L)無明顯促細胞增殖作用(P＞0.05)。Real-timePCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):UⅡ濃度依賴性地增加PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原基因表達;Westernblotting結(jié)果顯示:UⅡ可濃度

11、依賴性地增加PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原蛋白表達(P＜0.05，P＜0.001)。其中UⅡ(10-7mol/L)，促膠原合成作用最明顯(P＜0.001)，UⅡ(10-10mol/L)無明顯促膠原合成作用(P＞0.05)。
　　 3.Real-timePCR及Westernblotting分別從基因及蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn):UⅡ可誘導ERK1/2磷酸化，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶抑制劑PD98059可顯著抑制磷酸化ERK1/2基因及蛋白表達(P＜0

12、.05，P＜0.001)。
　　 4.UⅡ受體拮抗劑Urantide可抑制UⅡ的促肺動脈平滑肌細胞增殖，促Ⅰ、Ⅲ型膠原合成作用及誘導ERK1/2磷酸化作用。(P＜0.01，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究成功分離并培養(yǎng)了大鼠肺動脈平滑肌細胞，培養(yǎng)細胞純度達95％。是良好的實驗材料，提高了實驗的可行性及準確性。
　　 2.UⅡ濃度依賴性地促進PASMCs增殖，增加PASMCsⅠ、Ⅲ膠原的基因