兩種海洋雙殼貝類多不飽和脂肪酸合成相關基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids, PUFA）指雙鍵數(shù)>2且碳原子數(shù)>18的直鏈脂肪酸，而雙鍵數(shù)>3且碳原子數(shù)>20的PUFA則稱為高度不飽和脂肪酸（Highly unsaturated fatty acid, HUFA）。其中具有重要生理功能的PUFA主要有花生四烯酸（AA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），它們是生物體正常生長發(fā)育的必需脂肪酸。研究表明，海產貝類富含PUFA，但

2、是不具有或具有非常微弱的PUFA合成能力。近年來，陸續(xù)從章魚（Octopus vulgaris）、鮑（Haliotis discus hannai Ino）中克隆得到脂肪酸去飽和酶（Fatty acid desaturase, FAD）和脂肪酸碳鏈延長酶（Elongtion of very long chain fatty acid protein, ELOVL），填補了軟體動物PUFA合成途徑中關鍵酶基因研究的空白。本文對兩種華南地區(qū)

3、重要海水養(yǎng)殖品種：華貴櫛孔扇貝（Chlamys nobilis）和葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）的FAD和ELOVL基因進行克隆和功能鑒定，并對其組織表達特性進行研究，另外研究了華貴櫛孔扇貝FAD基因在胚胎發(fā)育過程中的表達量變化。主要結果如下：
　　1、采用RT-PCR和RACE-PCR方法，從華貴櫛孔扇貝和葡萄牙牡蠣中分別克隆得到一個FAD基因和一個ELOVL基因。扇貝FAD基因cDNA全長為1714bp

4、（不含polyA），1287bp的開放閱讀框編碼了428個氨基酸，理論等電點為8.80，預計蛋白質分子量大小為50.5 KDa。牡蠣FAD基因cDNA全長1551bp，1311bp的開放閱讀框編碼437個氨基酸，理論等電點為8.37，預計蛋白質分子量大小為51.0 KDa。氨基酸序列與哺乳動物去飽和酶基因FADS1(Δ5)和FADS2(Δ6)擁有48％-53%相似性，與多種硬骨魚的FAD的相似度為48%-51%。具有典型的FAD的結構特

5、性。經功能鑒定，扇貝FAD基因的表達產物具有Δ5 FAD去飽和酶活性，牡蠣FAD基因的表達產物無明顯功能。
　　2、扇貝Elovl基因cDNA全長為1291bp,924bp的開放閱讀框編碼307個氨基酸，理論等電點為9.46，預計蛋白質分子量為36.1 KDa。牡蠣Elovl基因cDNA全長1433bp，930bp的開放閱讀框編碼310個氨基酸，理論等電點為9.52，預計蛋白質分子量大小為36.0 KDa。氨基酸序列與其他物種延長

6、酶的序列相似度為42%-45%。具有典型的碳鏈延長酶的結構特性，經功能鑒定，該兩個基因的表達產物具有碳鏈延長活性，功能和進化上與脊椎動物Elovl5較接近。
　　3、采用Real-Time PCR檢測上述四個基因的組織表達特性。華貴櫛孔扇貝Δ5 FAD基因在所有組織中都有表達，在性腺和肝胰腺中表達量最高，其次分別是外套膜、血液、鰓、腎臟和腸道，在閉殼肌中表達量最低。扇貝Elovl基因在所有檢測的組織中也都有表達，但是在血液中表達量

7、最高，其次分別是性腺、外套膜、肝胰腺、腸道和鰓，在腎臟和閉殼肌中表達量最低。葡萄牙牡蠣Δ5 FAD基因在檢測的所有組織中都有表達，在外套膜和鰓中的表達量最高，其次是性腺，在閉殼肌中的表達量最低。牡蠣Elovl在鰓和外套膜中表達量最高，在性腺中的表達量最低。
　　4、采用RT-PCR研究華貴櫛孔扇貝胚胎發(fā)育過程中Δ5 FAD基因表達量的變化。結果顯示Δ5 FAD在華貴櫛孔扇貝的整個胚胎發(fā)育過程中都有表達，在卵中的表達量最高，從原腸胚