基于體內(nèi)外指紋圖譜共有峰定性定量的銀黃制劑的質(zhì)量控制及潛在活性成分研究.pdf

1、目的：建立銀黃制劑體外指紋圖譜和體內(nèi)血漿指紋圖譜并標(biāo)定共有峰，通過(guò)對(duì)體內(nèi)外共有峰的定性定量分析，探究銀黃制劑的質(zhì)量控制方式及潛在活性成分。
　　方法：第一節(jié)利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(high performance liquidchromatography/diode-array detection，HPLC-DAD)建立銀黃制劑包括顆粒、膠囊和含片的體外指紋圖譜，并對(duì)共有峰進(jìn)行標(biāo)定，利用HPLC-DAD對(duì)共有峰中的綠原

2、酸、咖啡酸、木犀草苷、黃芩苷、木犀草素、千層紙素A-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A等10種活性成分進(jìn)行含量測(cè)定;利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,LC-MS)對(duì)銀黃制劑的指紋圖譜共有峰進(jìn)行定性分析。采用Sepax GP-C18柱(250mm×4.6 mm，5μm)，0.1％甲酸甲醇溶液(A)-0.1％甲

3、酸水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫。流速:1.0 mL/min;指紋圖譜分析檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A-O-葡萄糖醛酸苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm，綠原酸和咖啡酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，木犀草苷和木犀草素的檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL。采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，采用電噴霧(electrospray ionization，ESI)離子源，負(fù)離子模式(ESI-)檢測(cè)

4、，柱后分流比為3∶1，毛細(xì)管電壓3500 V，霧化氣壓力20 psi，干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度320℃，碎裂電壓110V。
　　第二節(jié)利用超高效液相-二極管陣列檢測(cè)器(ultra high performance liquidchromatography/diode-array detection，UPLC-DAD)建立大鼠口服銀黃制劑后的血漿指紋圖譜并標(biāo)定共有峰，利用LC-MS對(duì)共有峰進(jìn)行定性分析，利用UPLC-D

5、AD定量血漿指紋圖譜共有峰中黃芩苷、千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷，并應(yīng)用于其藥物動(dòng)力學(xué)研究。定性分析:采用Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1×50 mm，1.8μm);流動(dòng)相:0.2％甲酸水溶液(A)、乙腈(B)，梯度洗脫，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量2μL;柱溫:30℃，采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，采用ESI離子源，負(fù)離子模式(ESI-)檢測(cè)，毛細(xì)管電壓3500 V，霧化氣壓力20 psi，干燥氣流

6、速10 L/min，干燥氣溫度320℃，碎裂電壓110 V; SD大鼠按銀黃顆粒5 g/kg劑量給藥，每天兩次，連續(xù)三天，于末次給藥后2h眼眶取血300μL，以0.1％甲酸乙腈溶液為蛋白沉淀劑，定性分析血漿中的移形成分。定量分析及藥物動(dòng)力學(xué):色譜條件同大鼠血漿指紋圖譜定性分析條件，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇275 nm。蘆丁為內(nèi)標(biāo)，以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分別于給藥前及給予銀黃顆粒(5 g/kg，折合黃芩苷502.1 mg/kg)、黃芩苷(501.1 mg

7、/kg)、黃芩藥材(15 g/kg，折合含黃芩苷502.7 mg/kg)后于0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12，24，48 h眼眶取血300μL，以0.1％甲酸乙腈溶液為蛋白沉淀劑，利用WinNonlin6.0軟件進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算，考察黃芩苷、千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷三種成分在大鼠灌胃后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)及不同給藥方式之間的差異。
　　結(jié)果：第一節(jié)不同廠家銀黃制劑指紋圖譜相似度均大于0.89，各

8、批次樣品間的共有峰的相對(duì)峰面積相差較大。定量分析:10個(gè)組分的線性、回收率、日內(nèi)和日間精密度、準(zhǔn)確度、最低定量限(limit of detection，LOD)、最低檢測(cè)限(limit ofquantification，LOQ)、重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果良好，符合定量分析的要求，不同廠家及相同廠家不同批次的銀黃制劑之間10種化學(xué)成分含量差異較大。定性分析:在對(duì)指紋圖譜20個(gè)共有峰的定性分析中，共確認(rèn)和推測(cè)出了18個(gè)化合物，其中7種酚酸類化合物

9、均來(lái)源于金銀花，分別為3-O-咖啡?？鼘幩?、綠原酸、4-O-咖啡酰奎寧酸、咖啡酸、3，4-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸;2種環(huán)烯醚萜類化合物來(lái)源于金銀花，分別為馬錢子苷和段氧化馬錢子苷;9種黃酮類化合物均來(lái)源于黃芩，分別為木犀草苷、木犀草素、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A、千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、野黃芩苷。
　　第二節(jié)通過(guò)對(duì)血漿指紋圖譜共有峰的標(biāo)示，在大鼠血漿中共測(cè)到了1

10、4種移行成分，其中原型成分有10種，均來(lái)源于黃芩苷，分別為木犀草苷、黃芩苷、木犀草素、千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A及兩種體外定性分析中未確定結(jié)構(gòu)的化合物;新出現(xiàn)的成分有4種，其中一種可能為5，6，7-三羥基黃酮-6-O-葡萄糖醛酸苷，另外3種化合物有待進(jìn)一步確認(rèn)。入血成分中黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-O-葡萄糖醛酸苷含量較高，經(jīng)過(guò)對(duì)其進(jìn)一步藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)，三種化合物的藥-時(shí)曲線均出現(xiàn)多峰，由藥動(dòng)

11、學(xué)參數(shù)比較，大鼠口服給予黃芩苷與口服給予黃芩藥材和銀黃制劑后，血漿中黃芩苷的T1/2、 Tmax、曲線下面積(area under curve，AUC)等參數(shù)差異顯著，黃芩藥材組和銀黃制劑組之間黃芩苷的Tmax、AUC無(wú)顯著性差異。提示，中藥中多組分并存，影響單一組分的藥物動(dòng)力學(xué)行為。
　　結(jié)論：指紋圖譜與多組分定量相結(jié)合可有效控制銀黃制劑的質(zhì)量，體內(nèi)外共有峰定性分析結(jié)果提示3-O-咖啡?？鼘幩?、綠原酸、4-O-咖啡酰奎寧酸、咖啡