兒童肺炎流行特征、病原體診斷方法評(píng)價(jià)和肺炎鏈球菌多重PCR分型方法研究.pdf

1、急性呼吸道感染是兒童最為常見(jiàn)的疾病。在廣大發(fā)展中國(guó)家,肺炎是5歲以下兒童死亡的首要原因。自上世紀(jì)70年代以來(lái),兒童肺炎一直也是我國(guó)5歲以下兒童的首要死亡原因。然而,迄今為止,我國(guó)5歲以下兒童的肺炎死亡率和發(fā)病率等流行病學(xué)特征仍不清楚。對(duì)兒童肺炎病原體的正確診斷是預(yù)防和控制兒童呼吸道感染的關(guān)鍵所在。然而,由于難以獲取高質(zhì)量的下呼吸道標(biāo)本,肺炎病原體的診斷一直是醫(yī)學(xué)界的難題。深部吸痰法是近年發(fā)展起來(lái)的損傷性小的下呼吸道標(biāo)本采集方法。為了正確

2、地使用和推廣該方法,本研究結(jié)合鼻咽拭子的檢測(cè)結(jié)果,對(duì)深部吸痰法的有效性和特異性等進(jìn)行綜合性的評(píng)價(jià)。此外,為了了解我國(guó)肺炎鏈球菌菌株的血清分布和監(jiān)測(cè)其血清型的變更等,迫切需要尋找一種可替代莢膜腫脹試驗(yàn),且適用于發(fā)展中國(guó)家流行病學(xué)研究的肺炎鏈球菌分型方法,以控制肺炎鏈球菌感染,并為制定肺炎鏈球菌疫苗免疫策略提供依據(jù)。
　　第一部分系統(tǒng)性回顧中國(guó)兒童肺炎流行病學(xué)特征
　　系統(tǒng)的檢索了1950-2007年間公開(kāi)發(fā)表的關(guān)于兒童肺炎發(fā)病

3、、死亡和病原體等相關(guān)的文獻(xiàn)。通過(guò)對(duì)NCBI,Cochrane,CNKI,VP,萬(wàn)方等主要數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索和手工檢索,共獲得6310篇文獻(xiàn)。經(jīng)過(guò)篩選、全文閱讀、質(zhì)量評(píng)價(jià)和文獻(xiàn)信息提取等,最終采納并進(jìn)入分析的文獻(xiàn)共142篇。
　　20世紀(jì)90年代,來(lái)自黑龍江、內(nèi)蒙古、寧夏、山東、北京、江蘇、云南、廣東等地以人群為基礎(chǔ)的兒童呼吸道感染監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,中國(guó)5歲以下兒童肺炎發(fā)病率為26.6％。兒童年齡越小,發(fā)病率越高。隨著年齡的增長(zhǎng),肺炎的發(fā)病率

4、迅速下降。不同地域兒童肺炎的發(fā)病率也有差異?？傮w來(lái)說(shuō),南方高于北方,尤其是西南、華南地區(qū)比華北、華東地區(qū)高。
　　肺炎一直是我國(guó)兒童,尤其是5歲以下兒童的首位死亡原因。1991-2000年間,全國(guó)兒童死亡調(diào)查結(jié)果顯示兒童總死亡率隨著時(shí)間有所下降,肺炎在所有死亡原因中占首位。年齡不同,兒童肺炎死亡率也不相同。低年齡組兒童肺炎死亡率高,隨著年齡的增長(zhǎng),肺炎死亡率迅速下降。在各地區(qū)之間,兒童肺炎死亡率差異較大,西部地區(qū)的兒童肺炎死亡率比

5、中東部地區(qū)高,而北方地區(qū)兒童肺炎死亡率高于南方地區(qū)。
　　病死率是反映疾病嚴(yán)重程度的一個(gè)重要指標(biāo)。從年齡上看,新生兒的肺炎死亡率最高,達(dá)21.3％(95％CI:19.8％-22.9％)。5歲以下兒童的肺炎病死率明顯下降,僅為0.6％(95％CI:0.5％-0.7％)。北方地區(qū)兒童肺炎病死率為18.0‰(95％CI:13.7‰-22.2‰),高于南方地區(qū)的5.3％(95％CI:4.7‰-5.99‰)。西部地區(qū)兒童肺炎病死率高達(dá)11.

6、3960(95％CI:8.5‰-14.1‰),顯著高于中東部地區(qū)。
　　兒童肺炎的細(xì)菌檢出率為31.2％(95％CI:30.7％-31.8％),其中以新生兒肺炎的細(xì)菌檢出率較高。在陽(yáng)性分離細(xì)菌中,新生兒以金黃色葡萄球菌為較為常見(jiàn)。較大年齡兒童中,肺炎鏈球菌,流感嗜血桿菌的陽(yáng)性率也較高。不同年代、不同地區(qū)兒童肺炎的細(xì)菌學(xué)感染譜有所不同。
　　總而言之,我國(guó)屬于兒童肺炎高負(fù)擔(dān)國(guó)家,尤其是經(jīng)濟(jì)相對(duì)落后地區(qū)5歲以下兒童的發(fā)病率和死亡

7、率居高不下。
　　第二部分對(duì)深部吸痰法診斷兒童肺炎病原體的評(píng)價(jià)
　　本研究旨在對(duì)深部吸痰法診斷下呼吸道感染兒童病原體的可行性、有效性和特異性等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。研究以2006年3月.2007年3月期間于蘇州兒童醫(yī)院住院治療的下呼吸道感染住院兒童(病例組)和無(wú)呼吸道感染的外科患兒(對(duì)照組)為研究對(duì)象,在征得其父母或監(jiān)護(hù)人的知情同意之后,對(duì)研究對(duì)象父母或監(jiān)護(hù)人進(jìn)行面對(duì)面的問(wèn)卷調(diào)查、病史摘錄及病案回顧等以收集相關(guān)的信息,同時(shí)采集研究對(duì)

8、象的鼻咽拭子和深部吸痰標(biāo)本,送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測(cè),在標(biāo)本的采集和實(shí)驗(yàn)室操作過(guò)程中分別采取了嚴(yán)格質(zhì)量控制和盲法。研究共入選了839名兒童,其中66人因標(biāo)本采集不合格等原因而被剔除,最終773人(病例組379人,對(duì)照組394人)被納入數(shù)據(jù)分析。兩組研究對(duì)象在性別、年齡和入選時(shí)間等方面存在差異,并且86％的病例組兒童在入院前使用過(guò)抗生素。
　　根據(jù)研究假設(shè),對(duì)照組兒童的深部吸痰結(jié)果的陽(yáng)性率應(yīng)為零或很低,病例組兒童的深部吸痰的陽(yáng)性結(jié)果可

9、認(rèn)為是下呼吸道感染的病原菌。然而,研究結(jié)果與研究假設(shè)相比有差異。即無(wú)呼吸道感染癥狀的對(duì)照組兒童的深部吸痰標(biāo)本細(xì)菌陽(yáng)性率高,如流感嗜血桿菌陽(yáng)性率高達(dá)27.2％(95％CI:22.8％-31.5％),卡他莫拉菌的陽(yáng)性率為22.1％(95％CI:18.0％-26.2％),肺炎鏈球菌的陽(yáng)性率為8.4％(95％CI:5.6％-11.1％)。病例組兒童由于受到大量使用的抗生素的影響,深部吸痰標(biāo)本的細(xì)菌陽(yáng)性率相對(duì)較低,如流感嗜血桿菌陽(yáng)性率為15.3％

10、(95％CI:11.7％-18.9％),卡他莫拉菌的陽(yáng)性率為4.7％(95％CI:2.6％-6.9％),肺炎鏈球菌的陽(yáng)性率為10.3％(95％CI:7.2％-13.3％)。兩組對(duì)象深部吸痰法的流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。59名對(duì)照組兒童鼻咽部攜帶了肺炎鏈球菌,其中20名兒童的深部吸痰標(biāo)本肺炎鏈球菌陽(yáng)性,即深部吸痰法的假陽(yáng)性率為33.9％(95％CI:20.7-47.0％)。鼻咽拭子和深部吸痰法檢測(cè)結(jié)果一致性較高,K

11、appa值位于0.37至0.64之間。可見(jiàn)深部吸痰法的標(biāo)本受到上呼吸道正常菌群的干擾,假陽(yáng)性率高,特異性較差。
　　當(dāng)然,深部吸痰法也有其可取之處。雖然受到廣泛應(yīng)用的抗生素的影響,但與鼻咽拭子相比,深部吸痰法的細(xì)菌分離率高。根據(jù)對(duì)采樣部位的分析,結(jié)合鼻咽拭子的檢測(cè)結(jié)果,深部吸痰法的檢測(cè)結(jié)果可以反映細(xì)菌向下侵襲的趨勢(shì),對(duì)下呼吸道感染病原體的診斷有提示作用。結(jié)合臨床檢驗(yàn)的結(jié)果,如結(jié)合革蘭氏染色和瑞氏染色,局部痰液標(biāo)本中找到G+球菌和膿

12、細(xì)胞,有助于肺炎鏈球菌等常見(jiàn)呼吸道感染細(xì)菌的分離;血液中C反應(yīng)蛋白水平和中性粒白細(xì)胞計(jì)數(shù)等,可以有助于下呼吸道感染病原體的診斷。
　　綜上所述,深部吸痰法檢測(cè)下呼吸道感染病原菌的特異性較差,容易受到上呼吸道攜帶細(xì)菌的干擾,不適合直接用于兒童肺炎病原體的診斷。
　　第三部分肺炎鏈球菌多重PCR分型方法的研究
　　本研究結(jié)合我國(guó)兒童肺炎鏈球菌常見(jiàn)的血清型和基因庫(kù)序列分析,設(shè)計(jì)血清型特異的PCR引物,以初步建立肺炎鏈球菌多重

13、PCR分型方法。通過(guò)與傳統(tǒng)的肺炎鏈球菌血清分型方法一莢膜腫脹試驗(yàn)和經(jīng)典的分子分型方法多位點(diǎn)序列分型方法(MLST)進(jìn)行比較,研究和評(píng)價(jià)多重PCR的分子生物學(xué)分型方法用于判別肺炎鏈球菌血清分型的可行性、敏感性和特異性,旨在尋找一種適合于我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查和研究的肺炎鏈球菌血清分型方法。
　　根據(jù)肺炎鏈球菌血清型相關(guān)基因cps的結(jié)構(gòu)和組成,以及國(guó)內(nèi)既往研究結(jié)果,設(shè)計(jì)我國(guó)較為常見(jiàn)血清型1,3,5,6,7F,9V,14,15A,15B/C,

14、18C,19F,19A,20,22F,23F等的特異引物,并優(yōu)化建立了多重PCR反應(yīng)體系。從臨床分離的肺炎鏈球菌中成功區(qū)別血清型19F,19A,23F,14,18C,6A/B,15A,15B/C等常見(jiàn)血清型。對(duì)多重PCR的的初步分型結(jié)果,進(jìn)行普通PCR反應(yīng)驗(yàn)證和PCR反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)序等確認(rèn)分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　多重PCR分型結(jié)果與莢膜腫脹試驗(yàn)分型結(jié)果相比,63株肺炎鏈球菌中,兩者分型結(jié)果一致的有52株菌,結(jié)果一致性達(dá)82.5％(9

15、5％CI:73.2％-91.9％),靈敏度為89.2％(95％CI:79.2％-99.2％),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值82.5％(95％CI:70.7％-94.3％)。在分型結(jié)果不一致的11株菌中,7株莢膜腫脹試驗(yàn)尚未分出具體血清型別,多重PCR方法可區(qū)分其血清型,分別為血清型23F,19A,18C,6A/B等非常常見(jiàn)的血清型。此外,多重PCR方法還識(shí)別了兩種血清型19F和23F共存的現(xiàn)象。多重PCR分型結(jié)果與MLST分型結(jié)果相比,45株肺炎鏈球菌血

16、清分型結(jié)果一致的有40株,結(jié)果一致性達(dá)88.9％(95％CI:79.7％-98.1％),靈敏度為88.4％(95％CI:78.8％-98.0％),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100％。
　　可見(jiàn)多重PCR分型方法與莢膜腫脹試驗(yàn)和MLST分型結(jié)果一致性高,分型結(jié)果準(zhǔn)確,可以同時(shí)篩查多種血清型,具有快速、便捷、客觀等優(yōu)點(diǎn),其分型成本為各種分型方法中最低。此外,多重PCR方法可以對(duì)莢膜陰性肺炎鏈球菌菌株進(jìn)行分型,也可識(shí)別多種血清型共存的現(xiàn)象,還可直接用于