白介素-10對TGFβ-,1-誘導的大鼠肝星狀細胞表達CTGF及TIMP-1的影響.pdf

1、目的：肝纖維化(HF)是慢性肝病共有的病理改變，肝纖維化的進一步發(fā)展，可形成肝硬化，嚴重影響患者的健康與生命。肝星狀細胞(HSC)在肝纖維化過程中起核心作用。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)是強有力的致纖維化的細胞因子，促進HSC增殖活化，合成大量ECM，在纖維化進程中起重要作用。白介素-10(IL-10)是一種炎癥抑制因子，臨床和動物實驗表明，IL-10可減輕肝臟炎癥，抑制肝纖維化的發(fā)展，可望發(fā)展為抗肝纖維化藥物，但其作用機制尚未明確。

2、本研究通過用IL-10及TGFβ1單獨和共同干預體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細胞系γ-HSC99，采用半定量RT-PCR法檢測各組結締組織生長因子(CTGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)mRNA表達，用免疫細胞化學染色法觀察HSC表達α-平滑肌激動蛋白(α-SMA)的變化，進一步探討IL-10抗肝纖維化的作用機制。 材料與方法： 一、實驗材料 1、γ-HSC99細胞系為活化的大鼠肝臟星狀細胞。

3、 2、實驗試劑 TGFβ1及重組大鼠IL-10；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；Taq酶；引物；DMEM培養(yǎng)基；α-SMA一抗；SP試劑盒；DAB顯色系統(tǒng)。 二、細胞培養(yǎng) 將γ-HSC99細胞復蘇后接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5％恒溫CO2培養(yǎng)箱中，每1-2天以0.25％胰蛋白酶消化傳代。 三、RT-PCR法檢測 CTGF及TIMP-1 mRNA的表達用不同濃

4、度的IL-10(10、20、40ug/L)與TGFβ1(8ug/L)單獨和共同干預HSC 24、48、72h后，用Trizol試劑提取細胞總RNA，用分光光度法測定RNA含量及純度。用RNA PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應，RT-PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳(100V，30 min)，用GDS凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳結果，各帶用計算機圖像分析系統(tǒng)掃描定量。 四、免疫細胞化學法檢測α-SMA的表達 用IL-10(

5、20ug/L)與TGFβ1(8ug/L)單獨和共同干預HSC 24h后，采用免疫細胞化學染色法檢測α-SMA的表達，在光鏡下觀察細胞爬片α-SMA的染色，應用圖象分析儀器定性分析α-SMA的表達情況。 五、統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù) 以均數(shù)±標準差表示，各組之間是否存在顯著性差異分析采用One-wayANOVA分析，LSD-t檢驗。以P<0.05確定差異有無顯著意義。 結果： 1、半定量RT-PCR法檢測結果

6、 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳可見分別于383 bp(CTGF)和335 bp(TIMP-1)處的清晰擴增條帶?；叶确治鼋Y果顯示：TGFβ1組與空白對照組(A組)比較，CTGF及TIMP-1mRNA表達均明顯升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)：IL-10各濃度組(C、D、E組)與空白對照組比較，基因表達差別無明顯統(tǒng)計學意義(p>0.05)；同時加入TGFβ1及不同濃度的IL-10(F、G、H組)與TGFβ1組(B組)比較，CTGF及TIMP-1m

7、RNA表達均明顯降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨著IL-10濃度的升高，抑制作用越明顯。 2、免疫組化結果 DAB顯色后，有棕褐色顆粒著色的細胞為陽性細胞，TGFβ1組陽性細胞數(shù)較空白對照組明顯增多且染色顏色均偏深，故α-SMA的表達有所增加，IL-10單獨干預HSC細胞與空白對照組比較差異不大，而TGFβ1及IL-10共同作用HSC細胞與TGFβ1組細胞相比，陽性細胞數(shù)較少且染色顏色較淺，故α-SMA的表