泡桐叢枝植原體中國(guó)株系的分子鑒定及免疫膜蛋白基因表達(dá)研究.pdf

1、泡桐叢枝病(Paulownia witches'broom，)由泡桐叢枝植原體(Paulownia witchesphytoplasma)侵染引起，該病遍布我國(guó)各泡桐栽培區(qū)，分布于陜西、河北、山東、河南、安徽、湖南、湖北、江蘇、浙江、江西等地，嚴(yán)重地區(qū)發(fā)病率達(dá)80％以上，是泡桐生產(chǎn)上最重要的病害之一。據(jù)1990年統(tǒng)計(jì)，全國(guó)叢枝病發(fā)生面積達(dá)88萬(wàn)公頃，直接造成的經(jīng)濟(jì)損失超過億元。因此，對(duì)泡桐叢枝病防治的研究是泡桐生產(chǎn)中長(zhǎng)期亟待解決的問題。

2、 由于植原體在寄主體內(nèi)含量低，又無(wú)法進(jìn)行分離培養(yǎng)，致使對(duì)該病原物的研究受到了一定的限制，因此，本文用分子生物學(xué)方法對(duì)泡桐叢枝植原體進(jìn)行了分子生物學(xué)檢測(cè)，分離和克隆了與致病有關(guān)的免疫膜蛋白基因。研究結(jié)果如下： (1)用分子生物學(xué)方法對(duì)采自全國(guó)六個(gè)省區(qū)自然發(fā)病的泡桐叢枝病植株進(jìn)行植原體16S rDNA基因片段和延伸因子(EF-Tu)tuf基因的擴(kuò)增，將所得序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，我國(guó)大陸泡桐主栽區(qū)陜西、山西、甘肅、河南

3、、河北、山東各省與已經(jīng)報(bào)道的臺(tái)灣省泡桐叢枝植原體基本一致，均為同一個(gè)種，沒有株系的分化，全部歸屬于植原體16S r I-D組。16S rDNA和tuf基因的序列均已提交GenBank，序列登錄號(hào)依次為DQ851169和DQ851170。 (2)根據(jù)已發(fā)表的洋蔥黃化植原體全基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，從泡桐叢枝植原體中分離并克隆了免疫抗原膜蛋白Amp基因(PaWB-amp)，其長(zhǎng)696bp，GC含量為32.5％，編碼231個(gè)氨基酸。

4、所測(cè)序列已被Genbank收錄，登錄號(hào)為DQ515794。對(duì)泡桐叢枝．陜西株系(PaWB．Shaanxi)、翠菊黃化(AY)和洋蔥黃化(OY)植原體Amp核苷酸序列進(jìn)行比較，同源性達(dá)98.39％。利用ANTHEPROT5.0軟件對(duì)PaWB-amp進(jìn)行分析，可知該蛋白的分子量為24.7KDa，具有良好的抗原性。二級(jí)構(gòu)象中，螺旋形式占73％，折疊占11％，其余為無(wú)規(guī)則卷曲占16％，無(wú)轉(zhuǎn)角形式。具有兩個(gè)跨膜區(qū)，存在有多個(gè)潛在信號(hào)肽切割位點(diǎn)，其

5、中末端的第219個(gè)氨基酸(甘氨酸)處為最強(qiáng)切割位點(diǎn)，在該蛋白的中部未發(fā)現(xiàn)潛在的信號(hào)肽切割位點(diǎn)。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究該蛋白的功能奠定了理論基礎(chǔ)，并期望以此為基礎(chǔ)揭示植原體的致病機(jī)理。 (3)分別構(gòu)建了含有目的基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30-amp、pET30-amp603和pBV221-amp603，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌培養(yǎng)，在不同條件下誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE，結(jié)果均未能出現(xiàn)該蛋白的表達(dá)條帶。說明PaWB-amp對(duì)大腸桿菌具有毒性。