冬凌草內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:研究冬凌草內(nèi)生真菌與其次生代謝產(chǎn)物(冬凌草甲素)之間的相關(guān)性。篩選從冬凌草中分離出的內(nèi)生真菌中產(chǎn)冬凌草有效抗腫瘤的活性成分的菌株,將篩選出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行物理及化學(xué)方法的誘變以及對誘變后的變異菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化,從而獲得冬凌草甲素的高產(chǎn)菌株。并對篩選出的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,確定其分類學(xué)地位。并對此菌株進(jìn)行體外乳腺癌細(xì)胞抑制實驗,研究其抗癌活性。
  方法:本課題以冬凌草不同器官(葉片、莖)為實驗材料,采用組織塊分離法對冬凌

2、草進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離并純化至單一菌落,保存?zhèn)溆?,進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定,明確冬凌草內(nèi)生真菌的生物多樣性。并采用薄層色譜法及高相液相色譜法篩選出產(chǎn)冬凌草甲素的內(nèi)生真菌;采用紫外線誘變、亞硝酸鈉誘變和復(fù)合誘變等方法對產(chǎn)冬凌草甲素菌株進(jìn)行誘變處理,篩選出高產(chǎn)菌株,對此高產(chǎn)誘變菌株進(jìn)行單因素實驗和四因素三水平正交實驗對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,并利用高效液相色譜法測定突變菌株冬凌草甲素的產(chǎn)量;結(jié)合分子生物學(xué)理論對產(chǎn)冬凌草甲素的菌株M-J-5進(jìn)行鑒定;采用

3、MTT法檢測冬凌草甲素對人乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。
  結(jié)果:
  1、冬凌草內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的研究
  現(xiàn)已從冬凌草葉片及莖中分離出內(nèi)生真菌共256株,經(jīng)顯微結(jié)果鑒定這些內(nèi)生真菌分布在4目、6科、9屬中,青霉屬菌株鑒定出77株,占所有內(nèi)生真菌總數(shù)的30.1%,擬定為冬凌草內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌。
  2、產(chǎn)冬凌草甲素的冬凌草內(nèi)生真菌的研究
  對冬凌草葉片及莖中內(nèi)生真菌進(jìn)一步分離,利用薄層色譜法法和高效液相色

4、譜法對上述256株內(nèi)生真菌進(jìn)行檢測,篩選出2株產(chǎn)冬凌草甲素的菌株,M-J-5為產(chǎn)冬凌草甲素含量最高的菌株,冬凌草甲素產(chǎn)量為0.211g/L。該株內(nèi)生真菌分離自冬凌草的莖中。
  3、內(nèi)生真菌M-J-5生長曲線的測定及誘變育種
  利用紫外線、NaNO2誘變和紫外線-亞硝酸鈉、亞硝酸鈉-紫外線復(fù)合誘變的方法,對產(chǎn)冬凌草甲素的菌株 M-J-5進(jìn)行誘變處理,篩選出冬凌草甲素的高產(chǎn)突變菌株M-UH-4,該菌株的產(chǎn)量可達(dá)到0.219g

5、/L,與原始菌株M-J-5相比較冬凌草甲素的產(chǎn)量增加了4.11%,對該突變菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng),觀測其冬凌草甲素產(chǎn)量的變化,結(jié)果表明M-UH-4具有一定的遺傳穩(wěn)定性。
  4、高產(chǎn)誘變菌株M-UH-4發(fā)酵條件的優(yōu)化
  運用溫度、接種量、轉(zhuǎn)速、PH值、碳源、氮源等的單因素實驗和四因素三水平正交實驗的方法,確定高產(chǎn)誘變菌株M-UH-4最優(yōu)的發(fā)酵條件:設(shè)定PDB液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的初始pH為7.0,葡萄糖加入量為10.0

6、g/L、蛋白胨5.0g/L,以2%的接種量接種于裝樣量為50mL培養(yǎng)基中,搖床溫度設(shè)定為26℃恒溫,轉(zhuǎn)速為130r/min,連續(xù)培養(yǎng)6天。與原始培養(yǎng)條件對比,菌株M-UH-4的冬凌草甲素產(chǎn)量為0.221g/L,增幅4.74%。與誘變后相比增幅1.28%。菌絲干重為8.99 g/L,增幅17.9%,與誘變后相比增幅12.15、內(nèi)生真菌M-J-5的分子生物學(xué)鑒定
  通過CTAB法提取產(chǎn)冬凌草甲素的內(nèi)生真菌M-J-5的DNA,并對其進(jìn)

7、行ITS測序,同時選取NCBI數(shù)據(jù)庫中相似性高的序列與該內(nèi)生真菌的ITS序列進(jìn)行BLAST比對,并與其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果綜合分析,確定內(nèi)生真菌M-J-5為青霉屬青霉。
  6、MTT比色法檢測M-UH-4發(fā)酵液提取物對人乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。
  采用MTT法檢測不同濃度發(fā)酵液提取物對人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用,在稀釋10-3時,在24h、48h、72h時致死率分別為78.27%、83.62%、83.96%,結(jié)果表明冬凌草內(nèi)生真

8、菌M-UH-4次生代謝產(chǎn)物對人乳腺癌細(xì)胞具有較明顯的抑制作用。
  結(jié)論:通過對冬凌草內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物相關(guān)性的研究,得到了冬凌草中內(nèi)生真菌的類型及種群結(jié)構(gòu),充分說明了冬凌草中內(nèi)生真菌具有一定程度的生物多樣性;同時篩選出一株產(chǎn)冬凌草甲素的活性菌株(M-J-5),通過誘變獲得一株高產(chǎn)突變菌株(M-HU-4)提高了冬凌草甲素產(chǎn)量;并篩選出適合該誘變菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件;經(jīng)分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定表明該突變菌株為青霉屬青霉;通過體外抗

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