CD163分子在PRRSV-ADE中的作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種B類病毒性傳染疾病，該病毒在臨床上主要造成妊娠母豬的流產、死胎以及引起仔豬呼吸障礙，還會引起豬群的免疫抑制和持續(xù)性感染等免疫學特性。PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，易變異，具有抗體依賴性增強作用（ADE）。研究PRRSV的ADE作用機制對PRRS的防治和新型疫苗的研制具有重要意義。
　　PRRSV具有嚴格的細胞嗜性，在體內外均能夠入侵感染單核-巨噬

2、細胞，而受體是介導病毒入侵宿主的決定因素。目前人們對PRRSV感染PAM過程的認識是：首先HS將PRRSV粒子吸附到細胞表面，引起Sn N端唾液酸結合位點與病毒的GP5/M復合體結合，激活Sn信號通道誘發(fā)細胞的內吞作用，之后在CD163分子的作用下將PRRSV基因組mRNA釋放到細胞漿中，繼而完成細胞的復制過程。還有研究表明CD163分子的SRCR5的結構域可以與病毒粒子的GP2和GP4蛋白發(fā)生相互作用。然而目前對于CD163分子在PR

3、RSV入侵宿主細胞的過程中的作用機制還不是十分清楚，而且對其在PRRSV-ADE過程中的是否發(fā)揮作用的研究還未見報道。因此本試驗分4個片段克隆并原核表達CD163分子胞外區(qū)結構域，免疫小鼠得陽性血清，制備并純化其相應的特異性多克隆抗體，通過研究這些抗體是否能夠阻斷PRRSV和免疫復合物的感染來鑒定CD163分子在PRRSV入侵過程中的作用，以及探索其在PRRSV-ADE中的作用。
　　清道夫受體CD163蛋白大小是130KDa，故

4、被稱為M130蛋白，是Ⅰ型糖基化蛋白，富含半胱氨酸。經軟件預測分析豬PAM的CD163發(fā)現(xiàn)其包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質尾區(qū)，且胞外區(qū)含有一個信號肽（1-40AA）和9個富含半胱氨酸（SRCR）結構域，且1-9個SRCR結構域在CD163中的位置分別是54AA-151AA，161AA-258AA,268AA-365AA,375 AA-472AA,480AA-577AA，585AA-682AA,721AA-818AA,828AA-925AA，

5、931AA-1028AA。本試驗將CD163分子分四個片段進行克隆和原核表達，即CD163-P1（SRCR1-2），CD163-P2（SRCR3-4），CD163-P3（SRCR5-6）和CD163-P4（SRCR7-9）。用四種重組蛋白分別免疫小鼠制備多克隆抗體血清，經硫酸銨鹽析法和 DE-52離子交換層析技術二步法提取并純化得到四種純度較高的特異性抗體。用PBS灌洗法將豬肺泡原代巨噬細胞洗出并鋪板，之后加入四種純化后的抗 CD163

6、抗體和混合抗體孵育1h封閉 PAM細胞，再分別用Hn-1/06 PRRSV和4倍稀釋的PRRSV-IgG免疫復合物處理細胞24h和48h，并設置陰性對照和空白對照組。用已建立的PRRSVSYBR GreenⅠ實時定量PCR方法檢測感染細胞中PRRSV的mRNA水平再用GraphPad Prism5軟件進行處理所得到的數據。
　　試驗一首先從健康仔豬肺泡中收集豬肺泡巨噬細胞（PAM），提取細胞總 RNA，參照GenBank: EU0

7、16226.1四個不同片段設計四對特異性引物，再用RT-PCR方法擴增出四個CD163基因片段，長度分別為698bp、721bp、609bp和988bp，并將這些基因片段亞克隆到質粒載體PET-32a中，構建重組表達質粒PET-CD163-P1, PET-CD163-P2, PET-CD163-P3和PET-CD163-P4。將重組質粒轉化到表達菌BL21中，經IPTG誘導得到成功表達，表達蛋白大小分別約為44.2kDa、45 kDa、

8、41.4kDa和52.0 kDa，與預測的融合蛋白大小一致。通過優(yōu)化 IPTG誘導表達的最佳時間和最適濃度，大量表達重組蛋白 CD163-P1，CD163-P2，CD163-P3和 CD163-P4，并用尿素法洗滌純化重組蛋白。用四種純化重組蛋白分別免疫小鼠，制備抗四種重組蛋白的多克隆抗體，經間接ELISA方法檢測陽性抗體血清效價分別為1：10240，1：12800，1：25600和1：12800。采用硫酸銨鹽析法粗提抗體IgG，再經D

9、E-52纖維素離子交換層析技術方法純化粗提IgG，用紫外分光光度計測定蛋白濃度。
　　試驗二用試驗一所制備的四種抗體，以及四種抗體的混合物分別封閉PAM細胞1h，經PRRSV感染24h和48h，同時設置陰性對照和空白對照組，用已建立的絕對熒光定量PCR方法檢測感染細胞中PRRSV的mRNA水平，用GraphPad Prism5軟件進行處理所得到的數據。由試驗結果看出，PRRSV感染24h和48h時，鼠抗豬CD163-P1，CD16

10、3-P2和CD163-P4抗體封閉組病毒 mRNA復制水平與相應的鼠陰性 IgG對照組比較差異不明顯，而鼠抗豬CD163-P3抗體封閉組和混合抗體CD163-H封閉組的PRRSV mRNA拷貝數均顯著低于鼠陰性IgG組，并且鼠抗豬CD163-P3抗體封閉組在24h時間段的PRRSV mRNA水平是鼠陰性IgG對照組的0.78倍（P<0.01），在48h時是對照組的0.85倍（P<0.05）。表明此方法所制備的鼠抗豬CD163-P3抗體能

11、夠阻礙PRRSV感染PAM細胞，并暗示CD163-P3（SRCR5-6）可能參與PRRSV感染PAM細胞過程，其他片段不影響PRRSV的感染宿主過程，這與人們所認為的CD163分子的主要功能結構域可能是SRCR5相一致。同時這些還表明用本試驗方法所制備、提取和純化的抗體具有生物學活性，為進一步研究 PRRSV感染機制及PRRSV-ADE作用機制提供參考。
　　試驗三用試驗一所制備的抗體，以及四種抗體的混合物分別封閉PAM細胞，再以

12、4倍稀釋的免疫復合物（PRRSV-IgG）處理24h和48h，同時設立陰性對照和空白對照組以及純病毒組，用已建立的絕對熒光定量 PCR方法檢測感染細胞中 PRRSV的mRNA含量，用GraphPad Prism5軟件進行處理所得到的數據。結果顯示，在免疫復合物處理24h和48h時，鼠抗豬CD163-P1和CD163-P2抗體封閉組的PRRSV mRNA拷貝數與相應的鼠陰性IgG對照組比較均差別不大；鼠抗豬CD163-P3抗體組的PRRS

13、V增殖水平均卻顯著低于對照組，且鼠抗豬CD163-P3抗體封閉組在24h時間段的PRRSV mRNA水平是鼠陰性IgG對照組的0.87倍，在48h時是對照組的0.75倍（P<0.01）；鼠抗豬CD163-P4抗體組的PRRSV mRNA拷貝數均低于鼠陰性IgG對照組，但差異不顯著；而鼠抗豬CD163-H抗體組PRRSV mRNA拷貝數均顯著低于鼠陰性IgG對照組，在24h時間段的PRRSV mRNA水平是鼠陰性IgG對照組的0.88倍（

14、P<0.05），在48h時是對照組的0.83倍（P<0.05），表明鼠抗豬 CD163-P3抗體能夠影響PRRSV-IgG在細胞內的復制增殖，暗示受體CD163-P3可能參與免疫復合物在細胞內的增殖。我們推測免疫復合物侵入宿主細胞后通過PRRSV的GP2a和GP4蛋白與CD163分子相互作用，改變PRRSV的結構，促使mRNA釋放到細胞漿中，繼而完成PRRSV的復制增殖，而且發(fā)揮主要功能作用的部分是CD163-P3（SRCR5-6），而