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文檔簡(jiǎn)介
1、目的 利用基因工程技術(shù)從人扁桃體細(xì)胞cDNA中克隆出IL-21編碼基因,將其N(xiāo)末端成熟片段編碼基因在原核細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá),并進(jìn)行初步純化和抗原性檢測(cè).方法 以人扁桃體細(xì)胞經(jīng)PHA刺激的cDNA文庫(kù)為模板,經(jīng)PCR獲得IL-21全基因片段.測(cè)序確認(rèn)后,分別設(shè)計(jì)含BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)的引物,經(jīng)PCR獲得IL-21成熟肽的編碼基因.將此IL-21基因插入表達(dá)載體pGEX 4T-2并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,重組克隆經(jīng)酶切與測(cè)序確認(rèn)后
2、進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá).用瓊脂糖珠結(jié)合的純化和酶切方法,所得產(chǎn)物作蛋白印跡試驗(yàn)分析.結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳顯示重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切產(chǎn)物與理論大小相等.SDS-PAGE顯示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的大腸桿菌DH5α亦表達(dá)一與理論相符的條帶.目的蛋白約占總菌體蛋白的10％.并獲得了與理論值相符的純化條帶,在進(jìn)一步的蛋白印跡試驗(yàn)分析中發(fā)現(xiàn)表達(dá)的蛋白能與IL-2的單抗產(chǎn)生交叉反應(yīng).結(jié)論 我們構(gòu)建了人IL-21編碼基因克隆載體并獲得在大腸桿菌中的成功表達(dá)
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