肝癌組織中腫瘤相關巨噬細胞的鑒定及其藥物干預.pdf

1、肝細胞癌(以下稱肝癌，hepatocellular carcinoma，HCC)是中國第二和世界第三大腫瘤相關死亡的病因[1，2]。盡管外科手術和肝移植為肝癌提供了有效的治療措施，但肝癌根治性切除術后的5年復發(fā)率仍高達54.1-61.5％，其中62.4-77.8％發(fā)生在術后兩年以內，這些導致了肝癌患者的預后仍然很差[3]。人們一直以來都認為肝癌復發(fā)和轉移主要和腫瘤細胞本身的生物學特性有關。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞并不是孤立存在，而是處

2、在一個包括炎癥免疫細胞、基質細胞、血管內皮細胞、細胞因子、趨化因子等共同組成的復雜環(huán)境之中，這種微觀環(huán)境被稱為“腫瘤微環(huán)境”[4]?！把装Y破壞-組織修復”的惡性循環(huán)促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[5]。臨床上大部分肝癌患者有乙型或(和)丙型肝炎肝硬化背景。炎癥和肝硬化導致的細胞增殖異?？梢源龠M腫瘤的演進和進展[6]。因此，腫瘤的免疫微環(huán)境在肝癌的侵襲和轉移過程中發(fā)揮著重要作用。
　　腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated

3、macrophages，TAMs)是活躍于腫瘤為環(huán)境中的炎癥細胞的重要成分。它們的主要特點是誘導宿主免疫抑制，刺激血管生成，分泌腫瘤生長因子和誘導Ⅱ型炎癥反應[7]。TAMs被認為是替代途徑激活的巨噬細胞(alternatively activated macrophages，AAMs)或M2型巨噬細胞亞型[8]。以前的研究多利用泛巨噬細胞標志物(pan-macrophage marker)CD68作為標記識別腫瘤組織中的TAMs[9-

4、11]。由于腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞是由多種不同的巨噬細胞亞群組成，各自在不同的微解剖位置發(fā)揮不同甚至相反的作用。因此尋找更加特異的標志物對于識別肝癌組織中TAMs并探索其功能具有重要的意義。
　　由于肝癌細胞本身及肝硬化環(huán)境等原因，至今臨床上對肝癌治療有效的藥物很少。sorafenib作為酪氨酸激酶受體抑制劑，可以通過抑制肝癌組織中的血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor re

5、ceptor，VEGFR)、血小板衍生生長因子受體(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)阻斷腫瘤血管生成及通過抑制RAF/MEK/ERK通路直接影響腫瘤的凋亡過程進而抑制腫瘤生長的多點靶向治療藥物[12]。臨床實驗證明，sorafenib可以使晚期肝癌患者生存期提高3.8個月[13]。我所(復旦大學肝癌研究所)利用自主建立的人肝癌裸鼠模型篩選藥物發(fā)現(xiàn)α干擾素(Interferon-

6、α，IFN-α)可以有效抑制肝癌的生長[14]。臨床試驗也證實IFN-α可以有效預防肝癌患者術后的復發(fā)與轉移[15]。即便如此，兩種藥物對肝癌的療效仍不滿意。而且，以上兩種藥物臨床上均出現(xiàn)藥物耐受和副作用[16]。動物實驗證明sorafenib治療可能促進肝癌組織的血管生成的惡性反彈及腫瘤的轉移與復發(fā)，此種副作用的出現(xiàn)可能與腫瘤組織中的TAMs的誘導有關[17]。
　　因此本研究以TAMs為中心，尋找人肝癌組織中TAMs特異性標志

7、物闡述其重要性。觀察臨床有效的抗肝癌藥物對TAMs的影響并分析其機制。
　　第一部分CD206鑒定肝癌組織中的腫瘤相關巨噬細胞的可行性研究
　　CD206作為體外實驗中AAMs或M2型巨噬細胞的特異性標志物，其在腫瘤組織中的表達還未見相關報道。相對于體外細胞實驗，原位觀察人肝癌組織中TAMs的分布及其鑒定具有重要意義。因此本部分利用人肝癌和癌周組織標本，分離原代細胞，直觀反映炎癥CD206+細胞在肝癌組中的分布，分析CD20

8、6作為特異性標志鑒定識別肝癌組織中TAMs的可行性。
　　收集人肝癌和癌周組織標本，制作連續(xù)切片，免疫組織化學方法顯示，CD206在肝癌組織和癌周組織的表達完全不同。在肝癌組織中CD206表達在腫瘤間質的單核巨噬細胞中并與CD68有共表達現(xiàn)象，而在癌周其呈管狀表達，貼附于肝血竇內皮內壁上與CD68的表達無共表達現(xiàn)象。為進一步證實免疫組化的發(fā)現(xiàn)，我們分離新鮮肝癌組織和癌周組織的CD206+細胞、巨噬細胞及肝血竇內皮細胞(liver

9、sinusoidalendothelial cells，LSECs)。流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測以上各群原代細胞的CD206和CD68的表達發(fā)現(xiàn)。癌內和癌周CD206+細胞的CD68中位陽性率分別是96.6％和0.32％(范圍，94.5-98.2％和0.16-0.92％)。癌內和癌周巨噬細胞的CD206中位陽性率分別是33.8％和0.57％(范圍，0-73.4％和0.12-0.96％)。癌內和癌周LSECs的

10、CD206中位陽性率分別是0.64％和56.8％(范圍，0.37-0.89％和14.1-87.3％)。綜合免疫組化和流式細胞術結果，經邏輯分析，癌內CD206+細胞是巨噬細胞的亞群，而癌周CD206+細胞是LSECs的亞群。為進一步驗證CD206+巨噬細胞的真實身份，我們將分離的原代細胞體外培養(yǎng)。酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測上清液中的細胞因子水平發(fā)現(xiàn)，和CD206

11、-巨噬細胞相比，CD206+巨噬細胞分泌更高水平的M2型細胞因子(IL-10和TGF-β)和更低水平的M1型細胞因子(1L-β和IL-12)。將原代細胞與肝癌細胞系共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，CD206+巨噬細胞可以提高肝癌細胞系的移動和侵襲能力，而CD206-巨噬細胞對其無明顯影響。
　　因此得出結論，癌內CD206+細胞是一群表型和功能上接近TAMs的巨噬細胞亞群，癌周CD206+細胞則是LSECs的亞群。CD206可以作為特異性標志識別鑒

12、定肝癌組織中的TAMs。另外，我們也揭示之前未被發(fā)現(xiàn)的肝癌組織中巨噬細胞分布的特點，即TAMs只出現(xiàn)在癌內組織中而非癌周組織。
　　第二部分腫瘤相關巨噬細胞與肝癌患者預后及IFNα療效的關系
　　在第一部分的基礎上，本部分利用臨床患者的肝癌組織標本制作組織芯片，分析以CD206作為標志鑒定的巨噬細胞與肝癌患者根治性切除后的預后及術后應用IFN-α療效的關系。
　　首先，我們收集了兩群(訓練集(n=323)和驗證集(n=

13、401))在復旦大學附屬中山醫(yī)院肝外科經根治性切除治療的肝癌患者組織標本，制作組織芯片，經免疫組化CD206和CD68染色，利用圖像分析系統(tǒng)分析CD206在肝癌組中的表達。免疫組化發(fā)現(xiàn)癌內的CD206表達在單核.巨噬細胞上與CD68有部分共表達現(xiàn)象，而癌周CD206主要表達在肝血竇內壁。這和第一部分的觀察結果一致。之后，我們分析了CD206+細胞和患者預后的關系。驗證集中，癌內CD68+細胞的表達與肝癌患者的預后無關。癌周CD68+細胞

14、與患者總體生存時間(overall survival，OS)和無瘤生存時間(disease-free survival，DFS)均呈負性相關。CD206+細胞的表達和患者的OS(癌內，風險指數(shù)(HR)=2.790，P<.001：癌周，HR=1.774，P=.001)與DFS(癌內，HR=1.621，P=.003；癌周，HR=2.693，P<.001)呈負性相關，兩者聯(lián)合后可獲得更顯著的獨立預后價值(OS，HR=3.745，P<.001：

15、DFS，HR=3.061，P<.001)。驗證集中此結果得到證實。
　　之后，我們收集了術后IFN-α治療隨機對照臨床試驗中治療組和對照組肝癌患者組織標本(治療集)，制作組織芯片。免疫組化CD206染色，分析與IFN-α術后治療后肝癌患者預后的關系。結果顯示，治療組中，癌內CD206+細胞高表達者OS和DFS均高于癌內CD206+細胞低表達者。對照組中，癌內CD206+細胞高表達者OS和DFS均低于癌內CD206+細胞低表達者。治

16、療組中的癌內CD206+細胞高表達者OS和DFS均高于對照組中癌內CD206+細胞高表達者。
　　經與臨床病理資料比較和生存分析，癌內CD206+細胞與患者預后有關，而癌內CD68+細胞與患者預后無相關性。因此，從臨床意義的角度，癌內CD206+細胞也更接近TAMs。癌周CD206+細胞高表達患者經IFN-α治療后OS和DFS均得到延長，提示癌內CD206+細胞可能是IFN-α治療肝癌的重要靶點之一。
　　第三部分 IFNα

17、通過下調巨噬細胞HSP27的表達抑制腫瘤相關巨噬細胞的誘導
　　本所的研究證實，在高肝轉移肝癌裸鼠模型中，IFNα可以抑制腫瘤的生長和轉移。初步的研究發(fā)現(xiàn)，其抗腫瘤作用可能通過抑制血管生成。但具體機制還不明確。
　　我們收集經IFNα治療和對照組的高轉移肝癌裸鼠模型的組織標本，提取RNA，進行RT2 ProfilerTM PCR基因芯片分析后發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，IFNα治療組中熱休克蛋白27(heat shock prote

18、in27，HSP27)下調(P<.001)。為了尋找HSP27下調的原因，我們利用IFNα干預高轉移肝癌細胞株，收集后提取蛋白和RNA，進行Western Blot與PCR驗證，但我們發(fā)現(xiàn)，治療組和對照組HSP27在RNA水平無顯著性差異。因此我們推測，HSP下調的原因可能來源于腫瘤間質。近期有文獻報道，HSP27可以促進M2型巨噬細胞的誘導分化。因此，我們檢測了經IFN-α干預的人單核細胞系THP-1誘導的人巨噬細胞表型的變化及HSP