ALA-PDT對(duì)同種異基因小鼠骨髓移植后GVHD及GVL影響的初步研究.pdf

1、同種異基因造血干細(xì)胞移植由于供受者的組織相容性白細(xì)胞抗原（histocompatibility Leukocyte antigen,HLA）不同，在移植后極易引發(fā)移植物抗宿主?。╣raftversus host diseases, GVHD）。做為一種免疫反應(yīng)，它可累及全身多個(gè)組織和器官，嚴(yán)重危害患者的生命健康。 但如果完全去除這些導(dǎo)致GVHD 的移植物中的淋巴細(xì)胞，又會(huì)大大增加腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，如何解決這一棘手問(wèn)題，是目前

2、移植治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 光動(dòng)力治療（photodynamic therapy，PDT)方法目前已經(jīng)成為一種全新的腫瘤生物治療方法。PDT 的基本原理是：光敏劑與腫瘤組織具有較高的親和力，當(dāng)給予一定波長(zhǎng)的光照后，可發(fā)生一系列光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生單態(tài)氧以及其他活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)物來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。目前PDT主要應(yīng)用在實(shí)體瘤和皮膚疾病的治療領(lǐng)域,在造血干細(xì)胞移植治療血液系統(tǒng)惡性疾病方面的研

3、究甚少。在移植物中，那些引起GVHD 的T 淋巴細(xì)胞也可以類(lèi)似腫瘤細(xì)胞一樣聚集光敏劑，因此，PDT 可以有效地清除這部分T 淋巴細(xì)胞，來(lái)提高移植成功率。而移植物中還有一類(lèi)T 淋巴細(xì)胞，它們并不起介導(dǎo)GVHD 的作用，PDT對(duì)它們似乎也沒(méi)有影響，它們還可能在受者體內(nèi)起到一定的對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的作用。如果將移植物中這類(lèi)有益的T淋巴細(xì)胞保留下來(lái)，就有可能減少腫瘤的復(fù)發(fā)。 本研究使用光敏劑氨基乙酰丙酸（aminolevulinicacid，

4、ALA）對(duì)移植物進(jìn)行處理，旨在探討ALA－PDT 在異基因骨髓移植（ allogenic bone marrowtransplantation，allo-BMT）中的作用機(jī)制，是否在減輕GVHD 的同時(shí)保留一部分移植物抗白血病效應(yīng)（Graftversus leukemia，GVL）。 主要研究如下： 1．確定小鼠淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)rhIL-2、PHA 的最佳濃度取小鼠的脾臟，利用Ficoll-Hypaque 密度梯度離心

5、法分離淋巴細(xì)胞。并分別加入rhIL-2、PHA 培養(yǎng)5d,經(jīng)MTT 法檢測(cè)確定PHA、rhIL-2 的最佳濃度分別為：40μg/ml、25 U/ml。 2．確定絲裂霉素去增值的最佳濃度在受鼠的淋巴細(xì)胞中按照終濃度（μg/ml）10、20、25、30、40、50加入絲裂霉素培養(yǎng)5 d，經(jīng)MTT 法檢測(cè)確定25 μg/ml 絲裂霉素為最佳的實(shí)驗(yàn)濃度。 3．制備單向混合淋巴細(xì)胞，確定混合細(xì)胞比例將刺激細(xì)胞（受鼠淋巴細(xì)胞）和反應(yīng)

6、細(xì)胞（供鼠淋巴細(xì)胞）按濃度比為2：1、1：1、1：2 進(jìn)行混合培養(yǎng)，用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的殺傷效果，確定最佳的混合淋巴細(xì)胞比例2：1 作為混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（mixed lymphocyte culture，MLC）的濃度。 4．ALA-PDT 選擇性清除同種異基因小鼠激活的淋巴細(xì)胞的ALA 濃度在單向混合淋巴細(xì)胞中分別加入1.5、2.0、2.5 mmol/L ALA,培養(yǎng)4 h，然后給予一定波長(zhǎng)光照射后，加入刺激細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。應(yīng)

7、用MTT 法計(jì)算單向混合淋巴細(xì)胞對(duì)刺激細(xì)胞的殺傷率。在加入1.5 mmol/L ALA時(shí)單向混合淋巴細(xì)胞對(duì)刺激細(xì)胞的殺傷率最低。 5．ALA-PDT 減輕同種異基因小鼠骨髓移植后aGVHD反應(yīng)將經(jīng)過(guò)ALA-PDT 處理過(guò)的單向混合淋巴細(xì)胞及供鼠的3×107/ml 骨髓細(xì)胞共計(jì)0.5 ml，經(jīng)尾靜脈輸注到經(jīng)8.5 Gy 60Co 照射的受鼠體內(nèi)。與對(duì)照組相比，受鼠的一般情況、外周血WBC 增加情況、GVHD 反應(yīng)程度、細(xì)胞植入情況

8、均有所改善。 6．ALA-PDT 減輕急性淋巴細(xì)胞白血病（ acutelymphoblastic leukemia，ALL）小鼠同種異基因骨髓移植后GVHD反應(yīng)，并且保留了GVL效應(yīng)將經(jīng)過(guò)ALA-PDT處理過(guò)的單向混合淋巴細(xì)胞聯(lián)合供鼠的骨髓細(xì)胞輸注給ALL小鼠體內(nèi)，ALL受鼠的體重增長(zhǎng)情況、造血功能恢復(fù)情況及無(wú)病生存時(shí)間等指標(biāo)明顯好于對(duì)照組。 根據(jù)以上的結(jié)果，得到如下的結(jié)論：（1）ALA-PDT 能夠選擇性清除小鼠同種異