烏魯木齊市生活飲用水中有機(jī)物現(xiàn)狀及其類雌激素效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：目前已知的有機(jī)物種類約700萬(wàn)種,其中人工合成的有機(jī)物種類達(dá)十萬(wàn)種以上且以每年2000種的速度遞增。很多有機(jī)污染物本身有一定的生物積累性和致癌、致畸、致突變的三致作用，一些有機(jī)物對(duì)人的生殖功能可以產(chǎn)生不可逆的影響，是人類的隱型殺手。目前，發(fā)現(xiàn)我國(guó)很多城市的水源水和自來(lái)水中的有機(jī)物種類和數(shù)量相當(dāng)大，污染問(wèn)題突出，在一些城市的自來(lái)水中檢測(cè)到了具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的有機(jī)物。但是我區(qū)尚未開(kāi)展有關(guān)具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的有機(jī)物的監(jiān)測(cè)工作，而且

2、烏魯木齊市的主要飲用水來(lái)源為冰川融水，其有機(jī)污染物可能也會(huì)與其他以江河水為主要原水的地方有所區(qū)別。本研究旨在確定烏魯木齊市以地表水為主要來(lái)源的入廠水和出廠水中的主要有機(jī)物，對(duì)其可能來(lái)源進(jìn)行分析，為有機(jī)污染的防治提供科學(xué)依據(jù)，并考察當(dāng)前的自來(lái)水處理工藝對(duì)有機(jī)物的去除效果，為自來(lái)水廠的工藝改革提供參考依據(jù)。在此基礎(chǔ)上對(duì)有機(jī)物的雌激素效應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，探究環(huán)境有機(jī)物的雌激素效應(yīng)作用機(jī)制，探索水環(huán)境污染可行的生物標(biāo)志物。
　　 方法：1）于

3、2009年8月上旬采集烏魯木齊市三個(gè)水源地源水及其出廠水各100L。每20L用1支HLB固相萃取柱將水樣濃縮，溶劑洗脫，氮?dú)獯蹈珊?，?0L水樣用正己烷定容至1ml。用GC/MS進(jìn)行檢測(cè)，將得到的質(zhì)譜圖與用NIST2005庫(kù)比對(duì)檢索，對(duì)檢出的化合物定性。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算檢出物的峰面積，確定烏魯木齊市水中主要的有機(jī)物的種類；2）通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜確定保留時(shí)間，摸索合適的碰撞能量，對(duì)二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行優(yōu)化，建立氣相-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的在MRM模式下定

4、量分析鄰苯二甲酸甲酯、鄰苯二甲酸乙酯、鄰苯二甲酸丁酯、鄰苯二甲酸異丁酯、鄰苯二甲酸戊酯5種鄰苯酸酯類物質(zhì)的方法，并對(duì)烏魯木齊市生活飲用水中所含5種鄰苯酸酯類物質(zhì)進(jìn)行定量分析；3）根據(jù)鄰苯酸酯類物質(zhì)的定量結(jié)果和其他各種有機(jī)物的峰面積，得到烏魯木齊市生活飲用水中各種有機(jī)物的濃度。根據(jù)CAS號(hào)，在MSDS和Chemical book數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索三個(gè)水廠入廠水和出廠水中有機(jī)物的LD50，并查閱相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。以LD50為紐帶，以有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)為

5、基準(zhǔn)，對(duì)尚未設(shè)立國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的水中有機(jī)物進(jìn)行限值估計(jì)，將其引入Nemerow指數(shù)，對(duì)水質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。Nemerow指數(shù)越高，水質(zhì)越差；4）選擇體重15.93±2.67克的健康清潔級(jí)ICR雄性小鼠50只，適應(yīng)性喂飼1周后，隨機(jī)分為5組，每組10只。分別將HLB樹脂濃縮的各出廠水的有機(jī)物提取物溶于DMSO中。分別設(shè)為對(duì)照組（0.25 Ml·kg-1DMSO組）低劑量（1.25L水中有機(jī)提取物kg-1組）、中劑量（2.5L水中有機(jī)提取物kg-1

6、組）、高劑量（5L水中有機(jī)提取物kg-1組）、17β-雌二醇（1mg/kg-1）5個(gè)劑量組。每天經(jīng)口灌胃給予各組小鼠飲用水有機(jī)提取物，連續(xù)染毒15天，稱重，眼球采血，處死小鼠后，取睪丸進(jìn)行SOD、MDA、ACP、AKP、γ-GT活力各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，并檢測(cè)血清中的睪酮和卵泡刺激素；5）37℃、5%CO2、100%濕度在96孔培養(yǎng)板中用無(wú)酚紅的DMEM/F12去激素血清培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，以無(wú)水乙醇為溶劑對(duì)照，17-β-雌二醇（分別以

7、10-6mol/L、10-9mol/L、10-12mol/L）為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組為6個(gè)水樣提取物，每個(gè)提取物設(shè)相當(dāng)于原水量500、1000和2000ml的低、中、高3個(gè)劑量組，每個(gè)劑量設(shè)4個(gè)復(fù)孔。以Alamar Blue為細(xì)胞增殖檢測(cè)劑，分別在12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值（A），并計(jì)算平均A值和增殖率。根據(jù)細(xì)胞增殖情況，選擇中、高劑量組（即每個(gè)提取物設(shè)相當(dāng)于原水量1000和2000ml），在12孔板中無(wú)酚紅去激

8、素血清培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞48小時(shí)，染毒24小時(shí)，trazol法提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。從樣品中隨機(jī)抽樣，用普通PCR擴(kuò)增Hsp90AA1基因、Erα基因、ERRα基因，進(jìn)行凝膠電泳，在紫外燈下切膠，得到上述基因的純品。分別將所得的各基因的純品按101、102、103、104、105、106、107濃度梯度稀釋，用Depc水做陰控，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀制備各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用實(shí)時(shí)熒光定量法對(duì)Hsp90AA1基因、Erα基因、ERR

9、基因表達(dá)進(jìn)行定量分析；6）將MCF-7細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板中用無(wú)酚紅去激素血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，以無(wú)水乙醇為溶劑對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組為6個(gè)水樣提取物，濃度為各水樣增殖率最高的劑量組，細(xì)胞爬片，用熒光免疫化學(xué)法檢測(cè)測(cè)Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況，計(jì)算Bcl-2/Bax比率。
　　 結(jié)果：1）確定了烏魯木齊市以地表水為主要來(lái)源的原水和出廠水中的主要有機(jī)物有烷烴類、酯類、羧酸類、芳香烴、酮類、醇類、烯烴類、酰胺類共計(jì)8大類39種，其

10、中烷烴類在各水樣中檢出最多，其次為酯類、羧酸類、芳香性化合物，但與其他省市的同類研究比較，烏魯木齊市的地表水源污染物的種類較少；2）烏魯木齊市以地表水為主要來(lái)源的入廠水和出廠水中的主要有機(jī)物中在EPA黑名單中的有鄰苯二甲酸酯類，包括鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異辛基酯、鄰苯二甲酸丁基辛基酯、鄰苯二甲酸二（2-甲基丙基）酯；3）對(duì)烏魯木齊市以地表水為主要入廠水的三各水廠的入廠水和出廠水中的主要有機(jī)物進(jìn)

11、行分析評(píng)價(jià)，A廠即紅雁池水廠對(duì)烷烴類、酯類、羧酸類和芳香性化合物的去除率要高于B廠（城建股份水廠）和C廠（三甬碑水廠）；4）A入廠水的Nemerow評(píng)分遠(yuǎn)高于其他水廠的入廠水，提示A水廠的有機(jī)物污染狀況較其他水廠嚴(yán)重。各水廠入廠水的評(píng)分均高于出廠水的評(píng)分，說(shuō)明出廠水水質(zhì)優(yōu)于入廠水；5）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，烏魯木齊市以地表水為主要原水的三個(gè)自來(lái)水廠的出廠水中的有機(jī)物對(duì)雄性小鼠未呈現(xiàn)出明顯的抗雄激素作用；6）MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)染毒24小時(shí)

12、后，陰性對(duì)照組與水樣高、中劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與低劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；陽(yáng)性對(duì)照的中劑量組與水樣各劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性對(duì)照中劑量組對(duì)MCF-7細(xì)胞促增殖率最大，染毒24小時(shí)后，高、中劑量組的促增殖效應(yīng)強(qiáng)于低劑量組，但是染毒48小時(shí)后，各水樣低劑量組幾乎都顯示出了較高、中劑量組更強(qiáng)的增殖率；7）各組的Bax蛋白熒光灰度值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），各實(shí)驗(yàn)組Bax蛋白熒光灰度值低于陰性組。各組的Bcl-2蛋白熒光灰度值之

13、間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），除C出廠水組外，其它各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白熒光灰度值高于陰性組。各組的Bcl-2/Bax比率（Bcl-2蛋白熒光灰度值與Bax蛋白熒光灰度值的比）之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），各實(shí)驗(yàn)組的Bcl-2/Bax比率均高于陰性組（P＜0.05）；A源水組、B源水組和C源水組的Bcl-2/Bax比率分別高于A出廠水組、B出廠水組和C出廠水組（P＜0.05）；8）hsp90AA1的表達(dá)在高劑量組各水廠的入廠水和出

14、廠水之間比較均存在顯著性差異。B廠入廠水高劑量組MCF-7細(xì)胞hsp90的表達(dá)上調(diào)，明顯高于A、C水廠，但是B廠出廠水高劑量組對(duì)MCF-7細(xì)胞hsp90表達(dá)的影響，與其他各水廠的出廠水相比，并未顯示出顯著性差異；hsp90AA1、Erα、ERRα基因表達(dá)呈明顯正相關(guān)，hsp90AA1表達(dá)和Erα、ERRα表達(dá)的Pearson 相關(guān)系數(shù)分別為0.988和0.944（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：烏魯木齊市以地表水為主要原水的生活飲