抑制PI13K-AKT通路提高人腦膠質瘤U251細胞體外化療的效果.pdf

1、近年來的研究顯示，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3kinase，PI3K)在腫瘤信號轉導中起著重要的調節(jié)作用。細胞在一系列內外因素的作用下，通過啟動PI3K/Akt信號轉導通路，誘導細胞的增殖、分化，避免細胞發(fā)生凋亡。在腫瘤細胞逃避抗癌藥物的殺傷過程中，PI3K/Akt信號轉導通路可能起了極其重要的作用，因此PI3K/Akt信號轉導通路有望成為惡性腫瘤治療的新靶點。國內外已有多篇文獻報告關于在肺癌、胃癌、大

2、腸癌等惡性腫瘤中利用PI3K特異性抑制劑LY294002/Wortmannin來阻斷PI3K/Akt通路，從而提高惡性腫瘤的化療效果和降低惡性腫瘤細胞的耐藥性。本研究通過使用化療藥物順鉑(DDP)及替莫唑胺(TMZ)聯(lián)合PI3K特異性抑制劑LY294002對體外培養(yǎng)的人腦膠質瘤U251細胞進行實驗，來研究抑制PI3K/Akt通路后在人腦膠質瘤U251細胞體外化療中的相關性作用。
　　 本課題從兩個方面對PI3K/Akt通路在人腦

3、膠質瘤U251細胞中的作用進行研究：①抑制PI3K/Akt通路后對人腦膠質瘤U251細胞遷移及增殖的影響。②抑制PI3K/Akt通路后對人腦膠質瘤U251細胞凋亡的影響。
　　 第一部分，抑制PI3K/AKT通路對人腦膠質瘤U251細胞遷移及增殖的影響
　　 目的：研究探討抑制PI3K/Akt通路對人腦膠質瘤U251細胞體外化療中對細胞遷移能力及細胞增殖能力的影響，以及不同濃度的抑制劑對細胞遷移能力及細胞增殖能力的影響。

4、
　　 方法：將培養(yǎng)的處于對數(shù)期的人腦膠質瘤U251細胞接種于6孔板、96孔板中，實驗分為對照組和處理組，對照組中不加入任何藥物，處理組又分為單純使用抗腫瘤藥物DDP、TMZ組，抗腫瘤藥物DDP、TMZ聯(lián)合PI3K特異性抑制劑LY294002組，特異性抑制PI3K/Akt通路，其中抗腫瘤藥物濃度始終保持不變（DDP的終溶度為2.5ug/ml，TMZ的終溶度為8.5μg/ml）。劃痕實驗中LY294002的溶度分別為20umol/

5、L、40umol/L;MTT實驗中LY294002的溶度分別為5umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L。劃痕實驗分析細胞遷移能力的改變：MTT比色法檢測細胞增殖抑制率變化。
　　 結果：劃痕實驗結果顯示抑制PI3K/Akt通路能使細胞遷移能力受到限制，單純使用抗腫瘤藥物組U251細胞的遷移能力較對照組減弱；抗腫瘤藥物聯(lián)合LY294002組U251細胞的遷移能力較單純使用抗腫瘤藥物組的細胞遷移能力減弱，

6、在一定藥物溶度范圍內，且隨著LY294002溶度的增加，細胞遷移能力逐漸減弱。MTT比色法檢測U251細胞增殖抑制率結果顯示單純使用抗腫瘤藥物組中U251細胞增殖抑制率較對照組有抑制作用；抗腫瘤藥物聯(lián)合LY294002組中U251細胞增殖抑制率較單純使用抗腫瘤藥物組中U251細胞增殖抑制率增高，在一定藥物溶度范圍內，且隨著LY294002溶度的增加，細胞增殖抑制率明顯增加；隨著時間的增加，24h、48h、72h細胞增殖抑制率逐漸增加。<

7、br>　　 結論：1．通過抑制PI3K/Akt通路能有效的抑制U251細胞的遷移能力，使U251細胞遷移受到限制。2．通過抑制PI3K/Akt通路能有效的抑制U251細胞增殖，使U251細胞增殖速度減慢。3．通過抑制PI3K/Akt通路有效的減弱了U251細胞的遷移能力、抑制細胞的增殖速度，說明抑制PI3K/Akt通路能有效的提高U251細胞體外化療的效果。
　　 第二部分，抑制PI3K/AKT通路對人腦膠質瘤U251細胞凋亡

8、的影響
　　 目的：研究探討抑制PI3K/Akt通路對人腦膠質瘤U251細胞體外化療中細胞凋亡的影響，以及不同濃度的抑制劑對細胞凋亡的影響。
　　 方法：將培養(yǎng)的處于對數(shù)期生長的U251細胞接種于6孔板中，實驗分為對照組和處理組，對照組中不加入任何藥物，處理組又分為單純使用抗腫瘤藥物DDP、TMZ組；抗腫瘤藥物DDP、TMZ聯(lián)合PI3K特異性抑制劑LY294002組，其中抗腫瘤藥物濃度始終保持不變（DDP的終溶度為2.5

9、ug/ml，TMZ的終溶度為8.5μg/ml）。在流式細胞術、原位熒光顯微鏡觀察細胞凋亡和RT-PCR檢測caspase-3，caspase-9mRNA表達中，LY294002的終溶度均為20umol/L、40umol/L。實驗采用流式細胞術檢測U251細胞早期凋亡率；原位熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡的情況；RT-PCR檢測caspase-3，caspase9mRNA的表達。
　　 結果：流式細胞術檢測U251細胞早期凋亡率結果顯示

10、對照組中U251細胞的早期凋亡率為2.1％，單純使用DDP、TMZ組中U251細胞的早期凋亡率分別為15.7％、14.5％；抗腫瘤藥物DDP、TMZ聯(lián)合LY294002組中U251細胞的早期凋亡率分別為18.5％、29.7％;19.6％、35.6％。與對照組相比，單純使用抗腫瘤藥物組中U251細胞早期凋亡率較對照組增高：抗腫瘤藥物聯(lián)合LY294002組較單純使用抗腫瘤藥物組中U251細胞早期凋亡率增高，在一定藥物溶度范圍內，且隨著LY2

11、94002溶度的增加，U251細胞早期凋亡率明顯增高。原位熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡實驗結果顯示對照組中U251細胞早期凋亡陽性細胞數(shù)為6個，壞死陽性細胞數(shù)為2個，單純使用抗腫瘤藥物組中U251細胞早期凋亡陽性細胞數(shù)為9個，壞死陽性細胞數(shù)為1個，抗腫瘤藥物DDP聯(lián)合LY294002組中U251細胞早期凋亡陽性細胞數(shù)分別為12個、16個，壞死陽性細胞數(shù)均為3個。與對照組相比，單純使用抗腫瘤藥物組中U251細胞早期凋亡數(shù)較對照組增多；抗腫瘤藥

12、物聯(lián)合LY294002組中U251細胞早期凋亡細胞數(shù)較單純使用抗腫瘤藥物組增多，在一定藥物溶度范圍內，且隨著LY294002溶度的增加，U251細胞早期凋亡細胞數(shù)增多。RT-PCR結果顯示通過抑制PI3K/Akt通路，使caspase-3，caspase-9mRNA表達量增高。
　　 結論：1．通過抑制PI3K/Akt通路能有效增加人腦膠質瘤U251細胞的凋亡，促使U251細胞凋亡加快。2．通過抑制PBK/Akt通路有效的促進了