江浙蝮蛇蛇毒激肽釋放酶在麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)中的表達和優(yōu)化.pdf

1、本研究在成功克隆得到江浙蝮蛇蛇毒激肽釋放酶目的基因的基礎上，在蛇毒激肽釋放酶基因序列上引入BamHI和XhoI兩個酶切位點以及由六個組氨酸組成的組氨酸標簽，并將其與pCS2+表達載體相連，構建了質粒pCS2+/VK，經過酶切測序驗證插入方向正確且未引起堿基序列的變化。
　　將pCS2+/VK線性化后，進行體外轉錄，得到適合進行翻譯的模板mRNA。再將mRNA同自制麥胚抽提物以及翻譯緩沖液混合，26°C孵育16h，將反應后的混合物進

2、行SDS-PAGE電泳，能夠得到一條大約43kDa的條帶，經Westernblot驗證為所需要目的蛋白。
　　麥胚無細胞蛋白表達系統(tǒng)在安全準確的合成功能蛋白方面具有很大的潛力，但是能源物質的供應以及模板mRNA的穩(wěn)定性一直是影響系統(tǒng)產率的主要因素。本文中磷酸肌酸和丙酮酸作為提供ATP二次能源物質加入系統(tǒng)中，在對蛋白產率進行比較之后，發(fā)現(xiàn)磷酸肌酸更適合于麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)；為了提高mRNA模板穩(wěn)定性，向系統(tǒng)中補充了質粒載體、SP

3、6RNA聚合酶以及銅離子，并對這些條件進行了優(yōu)化，最終建立了一個高效快速的麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)。當向系統(tǒng)中加入30ng/μL質粒載體、15USP6RNA聚合酶、25mM磷酸肌酸以及5mMCu2+后，并在26°C反應16h時，蛇毒激肽釋放酶產量從0.13mg/mL提高到0.74mg/mL。
　　通過固定化金屬親和層析法(IMAC)對重組蛇毒激肽釋放酶進行分離純化，將純化后的蛋白透析凍干，將重組蛋白(1.3U/mg)與天然蛇毒激肽釋