組織工程骨-軟骨復(fù)合組織的構(gòu)建及體內(nèi)外形態(tài)學(xué)觀察的實驗研究.pdf

1、骨-軟骨復(fù)合組織多數(shù)存在于運動關(guān)節(jié)處，其發(fā)生、發(fā)育是在非常復(fù)雜的生物信號調(diào)控下完成的。一旦發(fā)育完成其將會保持相對恒定的解剖形態(tài)并發(fā)揮穩(wěn)定的功能，同時也就失去了再生功能，但會發(fā)生微小的生理性組織改建以滿足功能需要。此外，如果在發(fā)育過程中受到外來因素的影響，這一復(fù)雜組織的形成就會受到阻礙，導(dǎo)致發(fā)育不全甚至發(fā)育停止。這就提示我們，如果關(guān)節(jié)組織發(fā)生了損傷尤其是大面積缺損，由于其缺乏再生能力，僅依靠機體自身難以恢復(fù)。目前，現(xiàn)有的醫(yī)療技術(shù)還無法對這

2、類疾病進行非常有效的治療。
　　本研究的目的就是利用組織工程技術(shù)尋找一種科學(xué)的方法，在體外模擬骨-軟骨形成的條件，構(gòu)建出具有生物活性的組織工程骨-軟骨復(fù)合組織，用于修復(fù)關(guān)節(jié)缺損從而恢復(fù)其外形與功能。本研究通過對種子細胞、支架的篩選，選擇出適宜的種子細胞與支架，然后構(gòu)建出具有解剖形態(tài)的復(fù)合組織，并進行體內(nèi)移植的初步探索?；谶@一目的我們主要進行了以下幾方面的研究。
　　一、組織工程骨-軟骨復(fù)合組織種子細胞的篩選
　　1.

3、軟骨細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取及分離培養(yǎng)以2W齡新西蘭大白兔的耳軟骨、關(guān)節(jié)軟骨和骨髓為組織來源，采用組織塊酶消化法和全骨髓貼壁法進行不同細胞的分離培養(yǎng)、增殖與純化。同時采用高密度和低密度細胞培養(yǎng)方式，對原代及第三代細胞的增殖能力、細胞表型、細胞分泌功能等生物學(xué)特性進行分析。結(jié)果表明高密度培養(yǎng)的軟骨細胞尤其是純化的原代細胞具有良好的生物學(xué)性能，具有較強的增殖及分泌細胞外基質(zhì)的能力。而且耳軟骨及關(guān)節(jié)軟骨細胞在實驗中沒有表現(xiàn)出明顯的生物學(xué)差

4、別，為利用不同部位軟骨細胞并獲得大量原代細胞提供了依據(jù)。實驗結(jié)果同時提示，采用貼壁篩選法進行骨髓間充質(zhì)干細胞的擴增純化可提供大量純化的骨髓間充質(zhì)干細胞
　　2.骨髓間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)分化為了進一步篩選適宜的種子細胞，分別采用細胞非接觸式共培養(yǎng)誘導(dǎo)方式、條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)方式對骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外誘導(dǎo)。結(jié)果顯示不論采用何種誘導(dǎo)方式均可以將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為所希望的細胞，通過MTT、細胞周期、糖胺多糖分泌能力、堿性磷酸酶活性以

5、及細胞染色等檢測手段都證實誘導(dǎo)后的細胞具有良好的增殖分化能力，證實所培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞具有干細胞的特性。
　　通過對結(jié)果的進一步分析可以看出，骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化后，共培養(yǎng)誘導(dǎo)的細胞其各項生物學(xué)特性似乎要優(yōu)于條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的細胞，這可能與軟骨細胞分泌更多的細胞因子和基質(zhì)有關(guān)，但與原代軟骨細胞相比其細胞狀態(tài)及分泌功能等還有一定差距。而向成骨方向誘導(dǎo)則取得了明確的結(jié)果，其成骨能力是肯定的，同時在對照組可以觀察到骨髓間充質(zhì)

6、干細胞本身就具有成骨趨勢，這可能與其來源于骨髓有關(guān)。因此，為了對后續(xù)實驗產(chǎn)生盡量少的干擾因素，最終確定將原代軟骨細胞和成骨誘導(dǎo)的第三代骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞。
　　二、組織工程骨-軟骨復(fù)合組織支架的篩選
　　1.構(gòu)建骨-軟骨復(fù)合組織支架的形態(tài)學(xué)和物理性能檢測選用4組多孔支架，分別進行表面形態(tài)學(xué)、力學(xué)性能、體外降解等相關(guān)檢測，結(jié)果表明四組支架中明膠-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸鈉與明膠-陶瓷化骨支架基本符合實驗要求，并最終選定為

7、復(fù)合組織的支架。
　　2.組織工程骨-軟骨復(fù)合組織的體外構(gòu)建及生物學(xué)性能為了觀察支架與種子細胞間生物相容性以及能否促進細胞增殖分化等性能，本實驗進行了支架復(fù)合細胞的研究。此外為了增強細胞在三維培養(yǎng)條件下增殖分化能力，還在支架內(nèi)復(fù)合了生長因子控釋系統(tǒng)，同時將支架構(gòu)建為含有雙層結(jié)構(gòu)的整體支架，分別在成骨與非成骨誘導(dǎo)條件下觀察體外組織工程骨-軟骨復(fù)合組織的形成情況。結(jié)果表明采用含有雙層結(jié)構(gòu)的整體支架分層復(fù)合兩種細胞能夠在成骨誘導(dǎo)條件下形

8、成較為理想的組織工程骨-軟骨復(fù)合組織。
　　三、組織工程骨-軟骨復(fù)合組織的構(gòu)建及體內(nèi)移植實驗
　　1.組織工程骨-軟骨復(fù)合組織體內(nèi)異位移植采用熒光小鼠肋軟骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞為種子細胞，參照前期實驗方法與整體雙層支架復(fù)合，并在復(fù)合后第1、7、14d植入裸鼠皮下。觀察其體內(nèi)異位形成組織情況。經(jīng)過8W的連續(xù)觀察可以發(fā)現(xiàn)移植組織逐漸形成與天然組織類似的骨-軟骨結(jié)構(gòu)，而且通過熒光觀察新形成的組織系來自植入的復(fù)合組織。通過對實驗各

9、組的比較觀察發(fā)現(xiàn)細胞與支架復(fù)合后早期植入體內(nèi)更有助于組織的成熟，這可能與體內(nèi)環(huán)境含有更多的營養(yǎng)成分以及復(fù)合組織允許血管結(jié)構(gòu)的早期長入有關(guān)。
　　2.組織工程骨-軟骨復(fù)合組織修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)大部分缺損的實驗研究為了探討具有解剖外形的骨-軟骨復(fù)合組織修復(fù)關(guān)節(jié)大部分缺損的能力。實驗利用灌注快速成形技術(shù)并復(fù)合生長因子控釋系統(tǒng)構(gòu)建出具有三維解剖形態(tài)的骨-軟骨復(fù)合組織，然后進行自體原位移植。通過術(shù)后24W連續(xù)觀察及相關(guān)檢測，觀察到在體內(nèi)關(guān)節(jié)微環(huán)境