胰島素、睪酮、AngⅡ、Ang-(1-7)對(duì)體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的血管緊張素受體及細(xì)胞發(fā)育的影響.pdf

1、目的:
　　 原代分離及培養(yǎng)在位人體子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞，建立正常子宮內(nèi)膜的體外模型。通過檢測(cè)胰島素和睪酮作用于子宮內(nèi)膜細(xì)胞后血管緊張素受體的變化，以及AngⅡ和Ang-(1-7)作用于子宮內(nèi)膜細(xì)胞后細(xì)胞增殖和凋亡的變化，探討多囊卵巢綜合征(PCOS)患者RAS的變化與子宮內(nèi)膜發(fā)育的關(guān)系，以期為PCOS患者子宮內(nèi)膜病理改變以及治療提供新思路。
　　 方法:
　　 1、通過酶消化、二次濾網(wǎng)過濾、差時(shí)貼壁等方法對(duì)

2、30例正常在位子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行分離培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞純度，染色觀察細(xì)胞形態(tài)，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及生長(zhǎng)環(huán)境。
　　 2、予以不同濃度的胰島素(INS)(生理劑量10mIu/l，達(dá)PCOS劑量30mIu/l)、睪酮(T)(生理劑量10-9mmol/ml，達(dá)PCOS劑量10-5mmol/ml)刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞24、48、72小時(shí)，MTT法檢測(cè)INS、T對(duì)不同時(shí)間增殖期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-

3、PCR)方法測(cè)定INS、T對(duì)增殖期及分泌期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和腺上皮血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的1型受體(AT1R)、2型受體(AT2R)、血管緊張素1-7(Ang-(1-7))的受體(MAS)mRNA的表達(dá)的影響。
　　 3、予10-12mol/L～10-5mol/L濃度的AngⅡ、Ang-(1-7)分別作用于相同生長(zhǎng)期的增殖期與分泌期子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞與腺上皮24、48及72小時(shí)，MTT法檢測(cè)其OD值，觀察其對(duì)于細(xì)胞增殖的影響。予

4、10-6mol/L的AngⅡ和Ang-(1-7)作用于增殖期間質(zhì)細(xì)胞48小時(shí)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其對(duì)于細(xì)胞增殖與凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)成功率為97％。間質(zhì)細(xì)胞純度為95％，有限傳代，可存活一月。腺上皮純度為90％，不易傳代，可存活10天，傳代時(shí)間短時(shí)，姬姆染色較HE染色效果要好。間質(zhì)細(xì)胞隨時(shí)間增殖，48小時(shí)增殖最快，增殖期細(xì)胞較分泌期細(xì)胞增長(zhǎng)快。腺上皮24、48、72小時(shí)細(xì)胞數(shù)無明顯變化

5、。
　　 2、胰島素和睪酮刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞后的變化
　　 2.1、MTT法檢測(cè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖，OD值顯示:
　　 生理劑量，高劑量的INS均可促進(jìn)增殖期間質(zhì)細(xì)胞增殖，隨胰島素濃度的增加，胰島素促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用增強(qiáng)，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，且具有時(shí)間依賴性，48小時(shí)最強(qiáng)。不同濃度的睪酮均可抑制增殖期間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，且具有時(shí)間依賴性，48小時(shí)抑制作用

6、最強(qiáng)。
　　 2.2、子宮內(nèi)膜上AT1R、AT2R、MASmRNA的表達(dá)
　　 子宮內(nèi)膜上AT1R、AT2RmRNA分泌期表達(dá)較增殖期強(qiáng)(P＜0.05)，主要存在于子宮內(nèi)膜腺上皮(P＜0.01)。MASmRNA在腺上皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)于間質(zhì)細(xì)胞（P＜0.01），分泌期與增殖期表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 生理劑量睪酮、胰島素刺激后AT1R、AT2R、MASmRNA與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.0

7、5)，而高劑量INS、T刺激后各期腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞上AT1R、AT2R、MAS的表達(dá)均較對(duì)照組強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、AngⅡ、Ang-(1-7)對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖與凋亡的影響
　　 3.1、MTT法檢測(cè)OD值顯示:
　　 小于生理劑量的AngⅡ?qū)ψ訉m內(nèi)膜細(xì)胞增殖不發(fā)揮作用(P＞0.05)，生理劑量的AngⅡ促進(jìn)增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，超生理劑量時(shí)抑制增殖期和分泌期子

8、宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺上皮細(xì)胞增長(zhǎng)，隨濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，10-6mol/L作用最強(qiáng)。隨時(shí)間的增加，抑制作用也增加，48小時(shí)時(shí)抑制效果最強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 小于生理劑量的Ang-(1-7)對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖不發(fā)揮作用，生理劑量的Ang-(1-7)抑制增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)(P＜0.05)，超生理劑量時(shí)也抑制增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺上皮細(xì)胞增長(zhǎng)(P＜0.01)，隨濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，

9、10-6mol/L作用最強(qiáng)。隨時(shí)間的增加，抑制作用也增加，48小時(shí)時(shí)抑制效果最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.2、流式細(xì)胞學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:10-6mol/L濃度的AngⅡ與Ang(1-7)作用于增殖期間質(zhì)細(xì)胞48小時(shí)，S期細(xì)胞百分比減少，對(duì)照組為8.586±1.420，AngⅡ刺激組為5.146±1.339，Ang-(1-7)刺激組為3.850±0.9702處于活躍的DNA合成期（S期）的細(xì)胞減少，細(xì)胞周期由S

10、/G2-M向G0/G1期轉(zhuǎn)變，抑制細(xì)胞增殖，Ang-(1-7)較AngⅡ抑制作用強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)。10-6mol/L的AngⅡ組、Ang-(1-7)組與對(duì)照組相比凋亡指數(shù)增加，對(duì)照組為0.4880±0.0747，AngⅡ刺激組為0.6980±0.0907Ang-(1-7)刺激組為1.282±0.3539，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)，Ang-(1-7)較AngⅡ的促凋亡作用強(qiáng)。10-6mol/L的

11、AngⅡ、Ang-(1-7)抑制增殖期間質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，、Ang-(1-7)較AngⅡ作用強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 1、酶消化、二次濾網(wǎng)過濾、差時(shí)貼壁方法培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞省時(shí)，高效。間質(zhì)細(xì)胞可有限傳代，第2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究較好，腺上皮無法長(zhǎng)久生長(zhǎng)，生長(zhǎng)3-4天的腺上皮為實(shí)驗(yàn)研究最好時(shí)期。內(nèi)膜細(xì)胞的各種培養(yǎng)特性不隨月經(jīng)周期改變。
　　 2、胰島素促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，睪酮抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖。生理劑量