魚類腸型點(diǎn)狀氣單胞菌口服疫苗微粒的制備及免疫保護(hù)效應(yīng)研究.pdf

1、本論文包括三個(gè)實(shí)驗(yàn)，分別研究了腸型點(diǎn)狀氣單胞菌的分離和鑒定、半致死濃度的確定、腸型點(diǎn)狀氣單胞菌微粒的制備和腸型點(diǎn)狀氣單胞菌微粒對(duì)草魚的免疫保護(hù)效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先進(jìn)行了發(fā)病草魚病原菌的分離、純化、鑒定，確定了病原菌的半致死濃度，為下一步的免疫保護(hù)效應(yīng)做準(zhǔn)備；在微粒制備實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備疫苗微粒，采用對(duì)比實(shí)驗(yàn)確定適合草魚攝食的微粒直徑的實(shí)驗(yàn)條件；研究的關(guān)鍵是確定制備的疫苗微粒能否起到保護(hù)的作用，主要通過(guò)兩種方法來(lái)判定：第一

2、，免疫進(jìn)行過(guò)程中，不同時(shí)間段提取免疫草魚的血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定抗體的滴度大小，初步確定是否能夠引起草魚的免疫應(yīng)答。第二，通過(guò)草魚的保護(hù)實(shí)驗(yàn)確定保護(hù)率，為今后口服疫苗的大規(guī)模應(yīng)用提供依據(jù)。 1、腸型點(diǎn)狀氣單胞菌的分離、鑒定、半致死濃度的確定首先，分離、純化瀕臨死亡的患病草魚的致病菌，然后通過(guò)生化細(xì)菌鑒定管鑒別該細(xì)菌的種類，結(jié)果表明該細(xì)菌為腸型點(diǎn)狀氣單胞菌，設(shè)計(jì)不同的細(xì)菌濃度梯度注射草魚，獲得腸型點(diǎn)狀氣單胞菌對(duì)草魚的LC<,

3、50>為10<'6.2>CFU/ml。 2、腸型點(diǎn)狀氣單胞菌口服疫苗微粒的制備實(shí)驗(yàn)采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備口服疫苗微粒，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定微粒的的蛋白質(zhì)含量，進(jìn)而確定微粒的載藥量和包封率?？疾炀垡蚁┐既芤簼舛取⒕郾┧針渲瑵舛?、二氯甲烷/聚乙烯醇溶液體積比以及不同勻漿轉(zhuǎn)速對(duì)微粒粒徑、載藥量、包封率的影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出腸型點(diǎn)狀氣單胞菌口服疫苗制備條件為：聚乙烯醇溶液濃度為6％，聚炳烯酸樹脂的濃度為60 mg/ml，超聲功率為4

4、00 w，勻漿轉(zhuǎn)速為9500 r/min，可以保證微粒的直徑為10μm左右。同時(shí)菌體疫苗微粒的蛋白質(zhì)含量分別為6.32％：蛋白質(zhì)包裹效率為62.35％。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明微粒具有緩釋作用，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的標(biāo)準(zhǔn)。 3、腸型點(diǎn)狀氣單胞菌微粒對(duì)草魚的免疫保護(hù)效應(yīng)采用注射全菌疫苗組、佐劑疫苗組和通過(guò)制成飼料口服投喂疫苗微粒方法分三次免疫健康草魚，在第一次免疫后的不同時(shí)間段測(cè)定草魚的抗體滴度，結(jié)果顯示：全菌疫苗微粒組、佐劑疫苗組和口服疫苗組均

5、可檢測(cè)到明顯的血清抗體，但三種疫苗的免疫原性的強(qiáng)弱有所不同，佐劑疫苗組的抗體水平明顯高于其它2組(P<0.05)，其次為全菌疫苗組。同時(shí)結(jié)果表明口服疫苗組的抗體滴度隨著時(shí)間的推移下降幅度低于其他兩組，說(shuō)明口服疫苗具有緩釋的作用。保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示：全菌疫苗微粒組、佐劑疫苗組、口服疫苗組和對(duì)照組的存活率分別為55％、75％、37.5％及7.5％，根據(jù)各組草魚的存活率、平均存活時(shí)間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)全菌疫苗、佐劑疫苗和口服疫苗均對(duì)草魚具有保護(hù)效應(yīng)，與