十溴聯(lián)苯醚對背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的毒性及IGF-1的保護(hù)作用.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)是最常見的一類溴化物阻燃劑，在環(huán)境中持續(xù)存在難以降解，并且可在食物鏈中不斷聚集，現(xiàn)已成為一種普遍存在的環(huán)境污染物。十溴聯(lián)苯醚(decabrominated diphenyl ether,BDE-209)是PBDEs同源物中最常見的一種，對人類的健康可造成諸多不利的影響。BDE-209可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)毒性，但其作用機(jī)制還未被闡明。胰島素樣生長因子-1（in

2、sulin-like growth factor-1，IGF-1）是作用于神經(jīng)元的多功能多肽神經(jīng)生長因子，在神經(jīng)元存活、軸突生長、神經(jīng)元分化和維持突觸連接中發(fā)揮重要作用。本研究利用體外培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元研究了BDE-209對周圍感覺神經(jīng)元的毒性作用機(jī)制以及IGF-1對于BDE-209所致神經(jīng)毒性的作用及機(jī)制。
　　第一部分
　　十溴聯(lián)苯醚對背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的毒性作用

3、r>　　DRG是周圍感覺神經(jīng)元胞體聚集之處，神經(jīng)肽免疫反應(yīng)神經(jīng)元和神經(jīng)絲免疫反應(yīng)神經(jīng)元是DRG神經(jīng)元的兩種主要的表型，降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene-related peptide，CGRP)和神經(jīng)絲-200（neurofilament-200，NF-200）分別是這兩種主要表型神經(jīng)元表達(dá)的標(biāo)志物。生長相關(guān)蛋白-43(growth-associatedprotein43，GAP-43)可在所有DRG神經(jīng)元亞群表達(dá)，可作為

4、神經(jīng)再生的標(biāo)記物。
　　為檢測BDE-209對DRG神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用，將分散培養(yǎng)48 h的大鼠DRG神經(jīng)元隨機(jī)分為5組:(1)BDE-209(10μmol/L);(2) BDE-209(20μmol/L);(3) BDE-209(40μmol/L);(4)二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶劑對照組;(5)正常對照組:DRG神經(jīng)元正常培養(yǎng)，不施加任何干預(yù)因素。DRG神經(jīng)元在以上分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48

5、h，然后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測定。用微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated protein2，MAP2)進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記后測量單個神經(jīng)元突起的長度，用水溶性四唑鹽-1(water soluble tetrazolium salt-l，WST-1)試劑盒進(jìn)行DRG神經(jīng)元細(xì)胞活力檢測，用Hoechst33342染色的方法檢測神經(jīng)元的凋亡情況，用GSH檢測試劑盒檢測GSH的表達(dá)水平，用活性氧試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reac

6、tive oxygen species，ROS)的變化，分別用real-time PCR分析技術(shù)和Western blot分析技術(shù)檢測不同濃度的BDE-209對DRG神經(jīng)元GAP-43、CGRP和NF-200的mRNA和蛋白水平的影響，分別用GAP-43、CGRP和NF-200和MAP-2進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記，檢測GAP-43、CGRP和NF-200在原位的表達(dá)。
　　結(jié)果顯示，BDE-209可使DRG神經(jīng)元突起的長度變短，神經(jīng)元活

7、力減低、凋亡率升高，GSH水平降低、ROS水平增高，神經(jīng)元再生標(biāo)志物GAP-43的mRNA、蛋白及原位的表達(dá)降低，CGRP和NF-200蛋白及其mRNA的水平下降，神經(jīng)肽免疫反應(yīng)和神經(jīng)絲免疫反應(yīng)神經(jīng)元表型比例降低，并且BDE-209的作用隨著其濃度的增高而增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，BDE-209可影響DRG神經(jīng)元的生長，并且對不同亞型的DRG神經(jīng)元都可產(chǎn)生毒性作用。
　　第二部分
　　IGF-1緩解十溴聯(lián)苯醚所致的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元

8、毒性的作用
　　IGF-1作為對神經(jīng)元有重要作用的多肽類神經(jīng)生長因子，可結(jié)合到在神經(jīng)元表達(dá)的IGF-1受體(IGF-1R)，并激活其下游的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase1/2, ERK1/2)和磷脂酰肌醇(-3)激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threonine k

9、inase，Akt)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。為探討IGF-1對BDE-209所致的DRG神經(jīng)元神經(jīng)毒性的作用及機(jī)制，將原代培養(yǎng)48 h的大鼠DRG神經(jīng)元隨機(jī)分為6組:(1)BDE-209(40μmol/L);(2) BDE-209(40μmol/L)+ IGF-1(20 nmol/L);(3) ERK1/2抑制劑PD98059(10μmol/L)+ BDE-209(40μmol/L)+ IGF-1(20 nmol/L);(4) PI3K抑制劑

10、LY294002(10μmol/L)+BDE-209(40μmol/L)+IGF-1(20 nmol/L);(5)PD98059(10μmol/L)+LY294002(10μmol/L)+BDE-209(40μmol/L)+IGF-1(20nmol/L);(6)對照組:不施加任何干預(yù)因素。PD98059和LY294002在應(yīng)用IGF-1之前30 min加入培養(yǎng)液。DRG神經(jīng)元繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，檢測神經(jīng)元突起長度、細(xì)胞活力、凋亡情況、G

11、SH和ROS的水平、神經(jīng)元再生標(biāo)記物GAP-43的表達(dá)以及神經(jīng)元表型的變化。
　　結(jié)果顯示，IGF-1可以明顯緩解BDE-209對DRG神經(jīng)元突起長度、細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡情況和氧化應(yīng)激程度的影響，并可以增加GAP-43和CGRP的表達(dá)，而對NF-200的表達(dá)沒有明顯作用。IGF-1的作用可被單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用PD98059或LY294002所抑制。以上結(jié)果表明，IGF-1對BDE-209損傷的DRG神經(jīng)元具有保護(hù)作用，并且主要作用于神