表達(dá)兔出血癥病毒Vp60蛋白細(xì)胞的構(gòu)建及間接ELISA方法的建立.pdf

1、兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）的基因組為一條單股正鏈的RNA分子，含有2個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），衣殼蛋白VP60是由位于5’端的開(kāi)放閱讀框（ORF1）編碼，它是兔出血癥病毒最為重要的保護(hù)性抗原。
　　目前該病的血清學(xué)診斷方法為傳統(tǒng)的人“O”型紅細(xì)胞的血凝抑制試驗(yàn)。由于 RHDV至今不能在體外培養(yǎng)，因此預(yù)防該病使用的疫苗仍然為落后的組織滅活苗。但組織滅活苗存在免疫效率低，生

2、物安全危險(xiǎn)高等諸多弊端；同時(shí)血凝抑制檢測(cè)方法存在主觀性強(qiáng)、重復(fù)性差和人血紅細(xì)胞獲取不易等缺點(diǎn)。這些嚴(yán)重限制了我國(guó)兔養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展，現(xiàn)實(shí)要求我們研究出快速穩(wěn)定的RHDV檢測(cè)方法和安全高效的基因工程疫苗。
　　本研究從兔病毒性出血癥主要結(jié)構(gòu)蛋白入手，旨在利用兔出血癥病毒VP60基因建立一種方便，快速，準(zhǔn)確的ELISA檢測(cè)RHDV特異性抗體的方法；同時(shí)建立一種能穩(wěn)定表達(dá) VP60蛋白的昆蟲(chóng)細(xì)胞系，嘗試開(kāi)發(fā) RHDV的基因工程亞疫苗。

3、鑒于此，我們克隆出VP60的編碼序列并將其插入pET-32a載體中，獲得的重組質(zhì)粒可在BL21菌株中以包涵體形式高效表達(dá)；利用包涵體粗純技術(shù)獲得了高純度的重組VP60蛋白并免疫實(shí)驗(yàn)兔，制備了具有高度特異性的多克隆抗體。同時(shí)，我們采用融合 PCR技術(shù)克隆了 VP60的優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)的兩個(gè)片段，插入pET-30a載體中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a/AB，轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞成功表達(dá)了分子量約為36Ku的RHDV VP60的優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)（AB）

4、重組蛋白。Western blot試驗(yàn)證明 AB融合蛋該蛋白能與RHDV抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。再以純化的AB蛋白為診斷抗原，成功建立了檢測(cè)RHDV抗體的間接ELISA方法。為了得到免疫原性的更好，產(chǎn)量更高且成本低廉的VP60蛋白，我們還將VP60基因克隆到真核表達(dá)載體 pMT/BIP-V5-HisA中，然后將重組質(zhì)粒 BIP/VP60與輔助質(zhì)粒pCoBlast共同轉(zhuǎn)染入果蠅S2細(xì)胞，利用滅稻瘟素進(jìn)行抗性篩選，再使用有限稀釋技術(shù)篩選單克隆細(xì)