小間隙吻合法聯(lián)合BMSCs移植修復(fù)周圍神經(jīng)斷裂的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：SD大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)、鑒定及凍存復(fù)蘇
　　目的：掌握SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法，并探討其生物學(xué)特性。
　　方法：無菌條件下取出SD大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，用含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞，離心，去上清，重懸，計(jì)數(shù)后，置于含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合貼壁分離的方法進(jìn)行純化。待細(xì)胞達(dá)90％融合時(shí)，胰酶消

2、化2-3min后進(jìn)行傳代。倒置顯微鏡下觀察原代及傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)。計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測(cè)定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，從而進(jìn)一步了解其生長(zhǎng)特性。通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)顯示24h后即可看到有少許細(xì)胞貼壁，剛貼壁的BMSCs仍保持圓形，48h貼壁細(xì)胞增多，開始呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，伸突，呈短梭形、三角或多角形。最初2～5天細(xì)胞增殖較慢，呈克隆樣生長(zhǎng)，細(xì)胞向四周伸展。第6-9天時(shí)細(xì)胞集落迅速增多，呈旋渦狀，并向

3、周圍不斷擴(kuò)大，原代培養(yǎng)12-15天，細(xì)胞80～90％融合，即可以傳代。一般情況下傳至第4、5代可獲得形態(tài)均一、增長(zhǎng)旺盛的BMSCs純化細(xì)胞。P2、P4、P6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本相同，分為潛伏期(第1-2天)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(第3-5天)和平臺(tái)期(第6-7天)，且?guī)状?xì)胞間生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第5代BMSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面抗原標(biāo)志物鑒定的結(jié)果顯示：CD90(99.8％)、CD29（93.7%）陽性，CD34(0.8％)、CD4

4、5(1.3％)陰性。
　　結(jié)論：
　　1、全骨髓培養(yǎng)結(jié)合貼壁分離法能夠在體外簡(jiǎn)單、快速的分離、純化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并使其能在體外迅速得到增殖。
　　2、采用全骨髓培養(yǎng)結(jié)合貼壁分離法分離培養(yǎng)的BMSCs性狀穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單實(shí)用，為BMSCs的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了良好的細(xì)胞模型。
　　第二部分自體神經(jīng)外膜小間隙吻合法構(gòu)建的神經(jīng)再生室內(nèi)植入BMSCs修復(fù)周圍神經(jīng)斷裂的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：設(shè)計(jì)自體神經(jīng)外膜小

5、間隙吻合法構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)再生室模型，并通過植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞改變神經(jīng)再生室的微環(huán)境，觀察其對(duì)損傷神經(jīng)的再生和修復(fù)作用。
　　方法：采用健康雄性清潔級(jí)SD大鼠32只，隨機(jī)分成2組，對(duì)照組（L-DMEM組）16只，實(shí)驗(yàn)組（BMSCs組）16只。各組大鼠左下肢坐骨神經(jīng)銳刀切斷后，均行自體神經(jīng)外膜小間隙吻合法修復(fù)。對(duì)照組神經(jīng)再生室內(nèi)注入50ul不含BMSCs的L-DMEM培養(yǎng)液，即L-DMEM組。實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)再生室內(nèi)注入50ul含BMS

6、Cs的培養(yǎng)液。通過一般狀態(tài)、光鏡下大體形態(tài)、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察比較兩組大鼠神經(jīng)再生和功能恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：術(shù)后4周免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周可見較多BrdU陽性細(xì)胞，對(duì)照組無BrdU陽性細(xì)胞，表明BMSCs能夠在局部神經(jīng)再生室內(nèi)存活并發(fā)揮修復(fù)作用。術(shù)后12周時(shí)，本實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)局部神經(jīng)再生室內(nèi)植入BMSCs的實(shí)驗(yàn)組相比于未植入BMSCs的對(duì)照組周圍

7、組織粘連較輕，神經(jīng)纖維較規(guī)則，結(jié)締組織增生不明顯，雪旺氏細(xì)胞增生明顯，數(shù)量較多，再生神經(jīng)軸突和髓鞘較為成熟。功能學(xué)指標(biāo)大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)結(jié)果顯示4周到12周SFI逐漸恢復(fù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，術(shù)后4周、8周、12周，實(shí)驗(yàn)組SFI恢復(fù)優(yōu)于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。神經(jīng)電生理檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組的坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、自體神經(jīng)外膜小間隙吻合法聯(lián)合BM