便攜式壓電生物傳感器檢測創(chuàng)傷感染細(xì)菌16S-23S rDNA間區(qū)的研究.pdf

1、背景
　　 感染仍然是創(chuàng)傷病人最常見的并發(fā)癥,引起創(chuàng)傷感染的病原體以細(xì)菌為主。多數(shù)學(xué)者在創(chuàng)傷感染的菌群調(diào)查中發(fā)現(xiàn),革蘭氏陰性桿菌感染率高于革蘭氏陽性球菌的感染率,并常有多種細(xì)菌的混合感染,且耐藥菌株逐年增加。早期快速診斷創(chuàng)傷感染細(xì)菌并合理應(yīng)用抗生素治療對于創(chuàng)傷感染的診治至關(guān)重要。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)鑒定法是診斷細(xì)菌感染最可靠的方法,但是耗時長、操作繁瑣。因此,迫切需要建立一種快速、簡易的創(chuàng)傷感染細(xì)菌診斷方法。
　　 分子生物

2、學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展使快速檢測病原微生物成為可能,其中,細(xì)菌基因診斷成為研究的熱點。目前,作為細(xì)菌的“活化石”,16S rDNA是常被選用細(xì)菌分類和鑒定的基因,但對于某些細(xì)菌而言種間差異較小,分辨力有限。16S-23S rDNA間區(qū)的長度和堿基序列相比于16S rDNA具有更強的特異性,可依此對不同種的菌群進(jìn)行“指紋”識別。但是,在某一臨床樣本中同時檢測多種細(xì)菌仍然是分子生物學(xué)技術(shù)面臨的難題之一。
　　 壓電DNA傳感器將壓電生物傳

3、感器靈敏度高與DNA雜交反應(yīng)特異性強的優(yōu)勢結(jié)合在一起,并可以實現(xiàn)多陣列平行分析,因此,在快速、準(zhǔn)確以及同時檢測多種臨床病原微生物方面具有廣泛的應(yīng)用前景。目前,我們已經(jīng)建立了壓電DNA傳感器檢測平臺,實現(xiàn)了對人乳頭瘤病毒、乙肝病毒、表皮葡萄球菌以及人巨細(xì)胞病毒等病原微生物的快速診斷。雖然如此,在這些研究中,壓電DNA傳感器還局限于對單個細(xì)菌或病毒進(jìn)行檢測。
　　 本研究構(gòu)建了一種便攜式2×5型壓電DNA傳感器陣列,實現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確

4、和同時檢測5種創(chuàng)傷感染細(xì)菌。我們篩選了3種較難培養(yǎng)的病原菌,即產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌和肺炎鏈球菌,以及2種引起創(chuàng)傷感染最常見的病原菌,即銅綠假單胞菌與大腸埃希菌,作為研究對象。針對創(chuàng)傷感染細(xì)菌16S-23S rDNA間區(qū)自行設(shè)計PCR擴增通用引物,應(yīng)用該傳感器陣列檢測PCR產(chǎn)物。檢測過程中引入了納米金顆粒質(zhì)量信號放大系統(tǒng),進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度。此外,以50例臨床樣本為檢測對象,以常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法為參照方法,對建立的壓電DNA傳感器陣

5、列檢測法進(jìn)行方法學(xué)比較和評價。
　　 方法
　　 1、利用Primer Premier5.0軟件,以細(xì)菌16S-23S rDNA間區(qū)為靶序列,在16SrDNA3'端與23S rDNA5'端保守區(qū)自行設(shè)計通用引物,篩選5種常見創(chuàng)傷感染細(xì)菌,提取其基因組DNA并進(jìn)行PCR擴增,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和測序。測序前先采用凝膠純化的方法分離片段最小的條帶,通常也是優(yōu)勢條帶,然后送上海英駿公司測序。
　　 2、將巰

6、基化的單鏈DNA探針固定于壓電DNA傳感器石英晶振金膜表面,封閉后加入合成的生物素化的互補靶DNA與之進(jìn)行雜交反應(yīng),最后用5 nm粒徑的鏈親和素標(biāo)記的膠體金追加標(biāo)記于雜交后的生物素化的靶DNA上,以增加石英晶振金膜表面的質(zhì)量負(fù)載,從而降低石英晶振的響應(yīng)頻率,進(jìn)一步放大頻移信號。優(yōu)化納米金顆粒溶液的使用濃度并分析該傳感器對合成靶序列的最低檢出限。
　　 3、各待測細(xì)菌DNA探針與16S-23S rDNA間區(qū)片段最小的拷貝序列互補,

7、并遵循探針設(shè)計的一般原則擇優(yōu)選取。標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物純化后變性解成單鏈,與固定探針并封閉后的壓電DNA傳感器陣列進(jìn)行雜交反應(yīng),引入上述納米金顆粒信號放大系統(tǒng),驗證各探針對靶細(xì)菌檢測的特異性,以銅綠假單胞為例分析該傳感器對菌懸液的最低檢出限。
　　 4、以50例臨床樣本為檢測對象,包括31例膿液和19例傷口分泌物,以常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法為參照方法,對建立的壓電DNA傳感器陣列檢測法進(jìn)行方法學(xué)比較和評價。
　　 結(jié)果
　　

8、 1、5種細(xì)菌基因組DNA PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜與預(yù)期一致,且與人類基因組DNA、白假絲酵母菌、HBV DNA無交叉反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn)同源性均在99.5％以上,由此可以證實該通用引物及PCR反應(yīng)體系對待測細(xì)菌PCR擴增的有效性和準(zhǔn)確性。
　　 2、當(dāng)納米金顆粒溶液終濃度為9％(體積比)時,頻移信號最大。我們將陽性結(jié)果的閾值設(shè)為本底(空白對照)頻移平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差,即(-X)+3SD,為24.5 Hz,

9、得到最低檢出限為10-12M。另外,對不同終濃度的陽性靶序列檢測后發(fā)現(xiàn),陽性靶序列終濃度從10-12至10-8M時,頻移與其終濃度的1g值之間具有顯著的線性關(guān)系,線性回歸方程為:y=20.941gx+285.88,相關(guān)系數(shù)為0.958,P＜0.01。
　　 3、各探針檢測陰性細(xì)菌所引起的非特異性信號與檢測陽性細(xì)菌所引起的特異性信號具有顯著性差異(P＜0.05),說明該傳感器交叉反應(yīng)弱,特異性強。以銅綠假單胞菌為例,最低檢出限為1

10、.5×102CFU/ml。另外,對不同濃度的銅綠假單胞菌懸液檢測后發(fā)現(xiàn),菌懸液濃度從1.5×102至1.5x102CFU/ml時,頻移與其濃度的1g值之間具有顯著的線性關(guān)系,線性回歸方程為:y=12.9211gx-2.597,相關(guān)系數(shù)為0.975,P＜0.01。
　　 4、參考方法檢測5種待測細(xì)菌17例陽性樣本中,QCM法檢測有1例為陰性,其余16例與之一致;而參考方法檢測5種細(xì)菌33例陰性樣本中,QCM法檢測有3例為陽性,其余

11、30例與之一致。我們選用McNemar檢驗對數(shù)據(jù)處理后發(fā)現(xiàn)兩種方法沒有顯著性差異(p＞0.05)。與作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的細(xì)菌培養(yǎng)法比較,QCM法檢測的靈敏度為94.12％,特異度為90.91％。
　　 結(jié)論
　　 1、自行設(shè)計的通用引物可以實現(xiàn)對多種創(chuàng)傷感染細(xì)菌16S-23S rDNA間區(qū)進(jìn)行PCR擴增,為細(xì)菌基因診斷提供了特異性強于16S rDNA的分子靶點。
　　 2、我們成功構(gòu)建了2×5型壓電DNA傳感器陣列,