殼寡糖對巨噬細胞IL-1β、TNF-α基因表達的影響.pdf

1、浙江大學碩士學位論文殼寡糖對巨噬細胞IL1β、TNFα基因表達的影響姓名：張小邊申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學和分子生物學指導教師：趙魯杭2002.5.1浙江大學碩上學位淪丈胞作為研究對象，通過體外實驗將殼寡糖作用于巨噬細胞，運用相對定量逆轉錄一聚合酶鏈反應(RT—PCR)技術和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)技術，檢測對巨噬細胞細胞因子IL一1B、TNF—n基因轉錄和翻譯水平的影響。f提取小鼠腹腔巨噬細胞并培養(yǎng)使貼壁生長后，巨噬細胞實

2、驗組中加入含＼、一定濃度殼寡糖的培養(yǎng)液，巨噬細胞對照組則只加培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。收集實驗組和對照組上清培養(yǎng)液留待ELISA實驗用，巨噬細胞通過異硫氰酸胍一酚一氯仿一步法提取總RNA。由于“管家基因”B—actin表達穩(wěn)定，其表達量比細胞因子基因高，所以相對定量RT—PCR實驗中，13一actincDNA的PCR引物量設為兩種細胞因子基因cDNA引物量的一半，確保B—actin和細胞因子產物量比較均勻。另外，對三種基因cDNA進行P

3、CR擴增動力學分析后，擴增循環(huán)數(shù)確定為30，此時三種cDNA都處于指數(shù)擴增期，確保可以用B—aCLin擴增產物量作為細胞因子PCR產物量的參比標準，從而可以對細胞因子基因轉錄水平進行比較。為r明確殼寡糖對巨噬細胞作用的最適濃度，首先通過RT—PCR確定作用最適濃度范圍為5～fiOug／ml。在此范圍內進一步實驗發(fā)現(xiàn)20～40ug／ml的殼寡糖能增強巨噬細胞lL113和TNF—a基因轉錄，效應有劑量依賴性。選定20ug／ml濃度的殼寡糖繼

4、續(xù)作用于巨噬細胞，RT—PCR結果表明可以明顯提高兩種細胞因子基因轉錄水平，實驗組IL一1p和TNF—o基因轉錄量為對照組的19倍左右(p001)：E1ISA實驗顯示，兩種細胞因子分泌也顯著增多，實驗組II一1B和TNI。a量分別為對照組的24倍和2倍左右(P001)，說明I，一殼寡糖能促進巨噬細胞兩種細胞因子基閡翻譯成蛋白質／∥本實驗表明，殼寡糖可以增強小鼠巨噬細胞IL—lp及TNF—n的基凼表達，使兩種細胞因子基因轉錄及翻譯水平增高