環(huán)孢素A衰減肺高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣池操縱性鈣內(nèi)流.pdf

1、肺高壓（Pulmonary Hypertension，PH）是一種漸進(jìn)的、復(fù)雜的并且常常可以致命的基本病理過程。雖然其確切的發(fā)生機(jī)制仍不清楚，但各類型的肺高壓都有一個(gè)共同特征即持續(xù)的肺血管收縮和血管重塑。無論是肺血管的收縮還是重塑都與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿 Ca2+濃度升高密切相關(guān)。先前研究證實(shí)在慢性低氧（Chronic Hypoxia，CH）與野百合堿（Monocrotaline,MCT）致PH模型大鼠中及肺動(dòng)脈高壓患者中鈣池操縱性鈣內(nèi)

2、流（Store-Operated Calcium Entry，SOCE）功能均有增強(qiáng)且胞漿鈣濃度升高，同時(shí)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）及活化T細(xì)胞核因子（Nuclear Factor of Activated T cells，NFATc）被激活。本研究進(jìn)一步在MCT致 PH模型大鼠中觀察 SOCE功能何時(shí)增強(qiáng)，并采用 CaN的抑制劑環(huán)孢素 A（cyclosporin A，CsA）通過不同給藥方式進(jìn)行干預(yù)觀察其對(duì)CH與MCT致PH模型大鼠SO

3、CE功能的影響，為其可能成為臨床上治療PH的靶向藥物提供病理生理學(xué)依據(jù)。
　　第一部分環(huán)孢素A抑制兩種肺高壓大鼠模型的形成
　　目的：觀察CH及MCT致肺高壓大鼠RVSP和RVMI隨時(shí)間的變化，并使用 CsA通過不同給藥方式干預(yù)觀察其對(duì)兩種肺高壓大鼠時(shí)間點(diǎn) RVSP及 RVMI的影響從而確定其如何抑制兩種肺高壓模型的形成。
　　方法：①模型建立方法：健康雄性SD大鼠150-160g按50mg/kg一次性腹腔注射MCT后

4、隨機(jī)分為1、3、5、7、14、21d六組。每組進(jìn)一步分為三小組，分別給予 CsA每天給藥干預(yù)、隔天給藥干預(yù)及空白對(duì)照組。健康雄性 SD大鼠200-220g用相同的方法進(jìn)行分組后暴露于低氧環(huán)境（氧濃度為10％）。正常組大鼠也進(jìn)行相同的分組后常規(guī)飼養(yǎng)。②血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)方法：分別測(cè)定上述各組大鼠RVSP，測(cè)量完畢后取出心臟測(cè)定RVMI。
　　結(jié)果：①M(fèi)CT注射后的早期大鼠RVSP尚未升高，1w時(shí)高于正常對(duì)照組，隨后呈時(shí)間依賴性升高直到3

5、w（只描述所觀察時(shí)間段內(nèi)的變化），CsA干預(yù)可抑制該模型1、2、3w時(shí)RVSP的升高，且每天給藥較隔天給藥抑制效果為顯著。②CH致PH模型早期RVSP呈時(shí)間依賴性升高，1w時(shí)達(dá)峰值，隨后穩(wěn)定于該水平。CsA干預(yù)無法抑制模型早期RVSP的升高，但能夠顯著降低這一模型的RVSP從第5d到第7d的增加幅度，并最終穩(wěn)定于一低水平。③正常雄性SD大鼠給予CsA，與正常對(duì)照組相比其RVSP及RVMI均無顯著差異。④MCT致PH模型早期RVMI尚未升

6、高，2w時(shí)顯著高于正常水平，隨后也呈時(shí)間依賴性升高直到3w。CsA干預(yù)可顯著抑制該模型2w、3w時(shí)RVMI的升高幅度，且每天給藥幾乎能夠完全抑制這一模型右心室肥厚的形成。⑤CH致PH模型早期（1d后）RVMI即呈時(shí)間依賴性升高直到3w，CsA干預(yù)可抑制相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)RVMI的升高幅度，且每天給藥時(shí)能夠完全抑制這一模型右心室肥厚的形成。⑥CsA能夠顯著抑制兩種模型肺血管重塑的形成。
　　結(jié)論：①CsA能夠抑制上述兩種肺高壓模型的形成，且

7、具有抑制右心室收縮壓的升高及右心室肥厚的雙重作用。②CsA對(duì)兩種模型右心室肥厚的抑制作用比在抑制RVSP升高中所起的作用更為顯著。
　　第二部分環(huán)孢素A衰減肺高壓大鼠 PASMCs[Ca2+]i的增加及SOCE功能的增強(qiáng)
　　目的：觀察MCT致PH模型大鼠PASMCs SOCE隨時(shí)間的變化及CsA對(duì)這兩種模型大鼠PASMCs SOCE功能的影響。
　　方法：在前已述及的建立模型的基礎(chǔ)上，采用：①酶解法培養(yǎng)原代PASMC

8、s；②fluo-3熒光檢測(cè)[Ca2+]i方法及 Mn2+淬滅 fura-2熒光方法，分別測(cè)定 CH3w及CsA干預(yù)大鼠的PASMCs由CPA誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流量及Ca2+內(nèi)流速率；③用上述同樣的方法測(cè)定MCT注射后1、2、3w及正常對(duì)照組1、2、3w及相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)CsA干預(yù)大鼠的PASMCs由CPA誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流量及Ca2+內(nèi)流速率。
　　結(jié)果：①成功培養(yǎng)各組大鼠PASMCs，且經(jīng)免疫組織化學(xué)鑒定純度在95%以上；②CH3w大鼠的PASMC

9、s[Ca2+]i及由CPA誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流量及Ca2+內(nèi)流速率均顯著高于正常水平，CsA干預(yù)能夠抑制其升高。③MCT注射后1w時(shí)大鼠的PASMCs由 CPA誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流量已顯著高于正常對(duì)照組，隨后呈時(shí)間依賴性升高直到3w。同時(shí)其[Ca2+]i也呈時(shí)間依賴性增加。CsA干預(yù)能顯著降低相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠的PASMCs由CPA誘導(dǎo)的鈣跨膜內(nèi)流量，每天給藥較隔天給藥有進(jìn)一步降低的趨勢(shì)。同時(shí)其也能夠抑制胞漿鈣濃度的增加。④正常對(duì)照組1、2、3w大鼠的PA

10、SMCs由CPA誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流量無明顯改變，但CsA每天給藥能輕度升高這一指標(biāo)。⑤MCT注射后1w時(shí)大鼠的PASMCs由CPA誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流速率已顯著高于正常水平，隨后呈時(shí)間依賴性升高直到3w。CsA干預(yù)能顯著降低相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠的PASMCs由CPA誘導(dǎo)的鈣跨膜內(nèi)流速率，每天給藥較隔天給藥有進(jìn)一步下降的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑥正常對(duì)照組1、2、3w大鼠 CPA誘導(dǎo)的PASMCs胞膜Ca2+內(nèi)流速率及幅度無明顯改變，但CsA每天給藥能輕度增加

11、Ca2+內(nèi)流速率及幅度。
　　結(jié)論：1. MCT模型的形成過程中SOCE增強(qiáng)及胞漿鈣濃度的增加均呈時(shí)間依賴性。
　　2.CsA能夠抑制上述兩種肺高壓模型SOCE功能的增強(qiáng)及胞漿鈣濃度的升高。
　　3.CsA能夠輕度增強(qiáng)正常大鼠SOCE功能。
　　綜上所述，SOCE功能增強(qiáng)在CH及MCT致PH大鼠的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。SOCE功能增強(qiáng)可介導(dǎo)PASMCs胞漿鈣濃度的升高，進(jìn)而促進(jìn)PA的收縮及重塑。CsA干預(yù)可部分