補腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵機制影響的比較研究.pdf

1、一、補腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵數(shù)目的影響
　　 目的：研究補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方、Ⅲ號方、逍遙丸對促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵數(shù)目的影響，以探討并比較補腎法、疏肝法誘發(fā)排卵的機制。
　　 方法：雌性未成年昆明小鼠102只，隨機分為17組，每組6只。其中1-4組為補腎法組，5-8組為疏肝法組，9-12組為補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方+逍遙丸組，13-16組為逍遙丸+補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方組，17組為對照組。實驗第1、2、3天，除對照組外，補腎

2、法組和補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方+逍遙丸組、疏肝法組和逍遙丸+補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方組，每只小鼠分別灌胃Ⅱ號方（高劑量或低劑量）、逍遙丸（高劑量或低劑量）0.4ml，共3天。實驗第3天13:00所有小鼠均腹腔注射PMSG(5IU/只)；實驗第4、5天補腎法組和補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方+逍遙丸組、疏肝法組和逍遙丸+補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方組，每只小鼠分別灌胃Ⅲ號方（高劑量或低劑量）、逍遙丸（高劑量或低劑量）0.4ml共2天；第5天13:00各組小鼠均腹腔注射hCG(5IU/只)

3、。第6天上午8:00處死小鼠，取輸卵管、卵巢，體式顯微鏡下刺破輸卵管壺腹部，計數(shù)卵子數(shù)。
　　 結(jié)果：單因素方差分析：與對照組比較，補腎法以補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量與Ⅲ號方高劑量序貫使用排卵數(shù)目多（P=0.003）；疏肝法以逍遙丸高劑量促進卵泡發(fā)育、逍遙丸低劑量誘發(fā)排卵序貫使用排卵數(shù)目多（P=0.007）。析因設(shè)計分析：補腎法促排卵使用補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量與低劑量有顯著差異（P=0.004），Ⅱ號方、Ⅲ號方高劑量序貫使用排卵數(shù)目多，

4、二者有交互作用(P=0.047)。疏肝法促排卵使用逍遙丸高、低劑量有顯著差異（P=0.039），序貫應(yīng)用高、低劑量排卵數(shù)目最多，二者有交互作用(P=0.046)。單因素方差分析：與對照組比較，逍遙丸+補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方組中逍遙丸低劑量與Ⅲ號方高劑量序貫使用排卵數(shù)增多(P=0.013)，析因設(shè)計分析二者無交互作用（P=0.838）；單因素方差分析：與對照組比較，Ⅱ號方高劑量與逍遙丸低劑量序貫使用排卵數(shù)多（P=0.039），析因設(shè)計分析二者無交

5、互作用(P=0.604)。
　　 結(jié)論：對促性腺激素預(yù)處理小鼠序貫使用補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方、Ⅲ號方高劑量卵巢排卵數(shù)目多，與陰精盛助卵泡發(fā)育、陽氣足使陰陽轉(zhuǎn)化順利有關(guān)；逍遙丸高、低劑量序貫使用排卵數(shù)目多，與血足精充促卵泡發(fā)育、疏肝理氣助陰陽轉(zhuǎn)化順利有關(guān)。兩法均有交互作用，即序貫使用可提高藥物療效。
　　 二、補腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠卵巢COX-2、PTX3、TSG-6影響的比較
　　 目的：研究補腎法、疏肝法

6、對促性腺激素預(yù)處理小鼠卵巢COX-2以及透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白PTX3、TSG-6表達的影響，以探討兩法對卵丘膨脹的影響而誘發(fā)排卵的機制及其異同。
　　 方法：將雌性昆明種未成年小鼠96只隨機分為正常組、對照組、補腎組、疏肝組，每組24只。實驗第1、2、3天，補腎組、疏肝組小鼠分別灌服補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量、逍遙丸高劑量，對照組、正常組灌服蒸餾水，共3天；實驗第3天8:00，補腎組、疏肝組、對照組小鼠腹腔注射PMSG(5IU/只)，48

7、h后腹腔注射hCG(5IU/只)，正常組在相同時間注射等體積生理鹽水；實驗第4、5天，補腎組、疏肝組小鼠分別灌服補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方高劑量、逍遙丸低劑量，對照組、正常組灌服蒸餾水，共2天。灌胃劑量均為0.4m1/只。各組小鼠均在注射hCG后0、4、8、12h處死，取雙側(cè)卵巢，液氮保存?zhèn)錂z。RT-PCR檢測COX-2、PTX-3mRNA在卵巢的表達，免疫組化法檢測COX-2、TSG-6蛋白在卵巢的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1

8、各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢COX-2mRNA及其蛋白的表達注射hCG后0、4、8h，各組小鼠卵巢COX-2表達呈升高趨勢，12h均下降。注射hCG后0h：與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢COX-2表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢COX-2表達下降但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后4h：與對照組比較，疏肝組和補腎組小鼠卵巢COX-2表達均下降，有統(tǒng)計學(xué)意義

9、(均P＜0.05)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢COX-2表達下降但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后8h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢COX-2表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；補腎組小鼠卵巢COX-2表達降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢COX-2表達降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。注射hCG后12h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢COX-2表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；補腎組

10、小鼠卵巢COX-2無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢COX-2表達降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2 各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢TSG-6蛋白的表達各時間點對照組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達逐漸增強，各時間點間比較，除4h、8h之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)外其余時間點間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。疏肝組各時間點小鼠卵巢TSG-6蛋白表達逐漸增強，各時

11、間點之間比較，除8h、12h之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)外其余時間點間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。補腎組各時間點小鼠卵巢TSG-6蛋白表達逐漸增強，各時間點之間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。注射hCG后0h：與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后4h：與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵

12、巢TSG-6蛋白表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。注射hCG后8h：與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達均增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達降低，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后12h:與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達均增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢TSG-6蛋白表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(

13、P＜0.01)。
　　 3 各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢PTX-3mRNA的表達注射hCG后0、4、8h，對照組小鼠卵巢PTX3mRNA表達逐漸增強，各組之間均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；注射hCG后12h，小鼠卵巢PTX3mRNA表達降低，與注射hCG后8h比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。注射hCG后0、4h：與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢PTX3mRNA表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0

14、.01)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢PTX3mRNA表達降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。注射hCG后8h：與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢PTX3mRNA的表達降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢PTX3mRNA表達降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。注射hCG后12h：與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢PTX3mRNA的表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢PTX3

15、mRNA表達降低，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：補腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵前卵巢COX-2mRNA及其蛋白的作用機制不同，疏肝法主要上調(diào)卵巢COX-2mRNA及其蛋白的表達，補腎法主要是下調(diào)卵巢COX-2mRNA及其蛋白的表達。補腎法、疏肝法對卵巢TSG-6、PTX3作用機制相似，均可上調(diào)排卵前卵巢TSG-6蛋白、PTX3mRNA的表達，從而促進了卵丘細胞外基質(zhì)形成，使卵丘充分膨脹有利于排卵。疏肝法、

16、補腎法上調(diào)TSG-6蛋白的表達可能是使排卵數(shù)目增多的原因之一。
　　 三、補腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠卵巢ADAMTS-1、CatL影響的比較
　　 目的：研究補腎法、疏肝法對促性腺激素預(yù)處理小鼠卵巢ADAMTS-1、CatLmRNA及其蛋白表達的影響，以探討兩種治法對排卵過程中促使卵泡壁破裂機制的排卵機制的異同。
　　 方法：動物分組及取材同第二部分。RT-PCR檢測卵巢ADAMTS-1、CatLmRN

17、A的表達，Western blot檢測卵巢ADAMTS-1、CatL蛋白的表達，免疫組化檢測卵巢PR、ADAMTS-1、CatL蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1 各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢PR蛋白的表達注射hCG后0h、8h、12h，與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢PR蛋白表達均增強，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。注射hCG4h，與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢PR蛋白表達均

18、無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。疏肝組與補腎組之間在4個時間點比較，小鼠卵巢PR蛋白表達均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2 各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢ADAMTS-1mRNA及其蛋白的表達4個時間點各組小鼠卵巢ADAMTS-1表達呈上升趨勢，12h達高峰。注射hCG后0h：各組小鼠卵巢ADAMTS-1表達不明顯。注射hCG后4h：與對照組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢ADAMTS-1表達增強

19、，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢ADAMTS-1表達降低但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后8h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢ADAMTS-1表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；補腎組小鼠卵巢ADAMTS-1表達降低但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢ADAMTS-1表達降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。注射hCG后12h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢ADA

20、MTS-1表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；補腎組卵巢ADAMTS-1表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢ADAMTS-1表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 3 各組促性腺激素預(yù)處理小鼠在注射hCG后0、4、8、12h卵巢CatLmRNA及其蛋白的表達4個時間點各組小鼠卵巢CatL表達呈上升趨勢，12h達高峰。注射hCG后0h：各組小鼠卵巢CatL表達均不明顯。注射hCG后4h：與對照

21、組比較，疏肝組、補腎組小鼠卵巢CatL表達均增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢CatL表達較低但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。注射hCG后8h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢CatL表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；補腎組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢CaL表達降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。注射hCG后12h：與對照組比較，疏肝組小鼠卵巢CatL表達增強但無統(tǒng)計學(xué)差異（

22、P＞0.05）；補腎組小鼠卵巢CatL表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與疏肝組比較，補腎組小鼠卵巢CatL表達增強，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.015)。
　　 結(jié)論：補腎法、疏肝法均可上調(diào)促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵前卵巢PR蛋白的表達，在注射hCG后12h，補腎法上調(diào)PR蛋白表達的作用較疏肝法強。補腎法、疏肝法均可上調(diào)促性腺預(yù)處理小鼠卵巢排卵關(guān)鍵蛋白水解酶ADAMTS-1、CatLmRNA及其蛋白的表達，促進了排卵斑的形成、卵