Tribble3在動脈粥樣硬化巨噬細胞凋亡中的作用及其信號轉導通路.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：TRB3在ox-LDL誘導巨噬細胞凋亡中的作用及其信號轉導機制
　　 目的：
　　 1.人單核源性巨噬細胞中TRBs的表達情況;
　　 2.ox-LDL對巨噬細胞TRB3的影響;
　　 3.TRB3在ox-LDL誘導的巨噬細胞凋亡中的作用及其信號轉導機制。
　　 方法：
　　 本研究以原代培養(yǎng)的人單核源性巨噬細胞為研究對象，采用實時定量逆轉錄聚合

2、酶鏈反應(real time RT-PCR)、蛋白免疫印跡(western blot)、酶聯免疫吸附(ELISA)等實驗方法，分別觀察:
　　 1.在巨噬細胞自然分化第1、3、5、7、9、11天檢測TRB1, TRB2. TRB3mRNA表達水平;
　　 2.不同濃度(0、5、10、25、5Oμg/ml)的ox-LDL, LDL處理巨噬細胞不同時間(0、4、8、12、24、48h)后，檢測TRB3 mRNA和蛋白含量;<

3、br>　　 3. TRB3基因克隆及腺病毒表達載體的構建:根據Genebank人TRB3基因序列，設計引物，提取人全血DNA，PCR擴增TRB3基因，回收目的基因并亞克隆至表達載體，經測序鑒定正確后，應用BD Adeno-X Expression System2腺病毒載體構建系統(tǒng)，構建含人TRB3基因的腺病毒質粒。經轉染293細胞行病毒包裝、擴增及純化，得到人TRB3腺病毒載體;
　　 4.設計、合成、篩選TRB3 siRNA

4、;
　　 5. TRB3腺病毒及siRNA分別轉染巨噬細胞，觀察ox-LDL刺激后巨噬細胞凋亡的變化(MTT檢測細胞存活率，ELISA法檢測凋亡細胞ssDNA含量，western blot檢測caspase-3);
　　 6. TRB3腺病毒及siRNA分別轉染巨噬細胞，觀察Akt, MAPKs及NF-κB信號通路的變化。
　　 結論：
　　 1.人單核源性巨噬細胞中TRBs的表達以TRB3為主，TRB3

5、主要分布于細胞核內;
　　 2.ox-LDL呈劑量和時間依賴性刺激巨噬細胞合成TRB3;
　　 3.TRB3部分參與ox-LDL誘導巨噬細胞凋亡過程;
　　 4.TRB3主要是通過抑制Akt、p38 MAPK/AP-1通路參與ox-LDL誘導的巨噬細胞凋亡;
　　 5.NF-κB參與ox-LDL誘導的巨噬細胞凋亡，但不參與TRB3介導的巨噬細胞凋亡過程
　　 第二部分：CHOP/TRB3通路在巨噬

6、細胞內質網應激中的作用
　　 目的：
　　 1.探討ox-LDL對人單核源性巨噬細胞CHOP, ATF4的調控作用;
　　 2.觀察ER stress時巨噬細胞TRB3的表達變化;
　　 3.探討巨噬細胞中TRB3與ATF4-CHOP的相互調節(jié)作用。
　　 方法：
　　 1.不同濃度(0、2.5、5、10、25,5Oμg/ml)的ox-LDL, LDL處理巨噬細胞不同時間(0、4、8、12

7、、24、48h)后，檢測CHOP, ATF4 mRNA含量;
　　 2.2μg/ml衣霉素刺激人單核源性巨噬細胞不同時間(Oh、4h、8h、12h、24h、48h)后，檢測TRB3 mRNA的表達;
　　 3. CHOP表達質粒轉染巨噬細胞后，觀察ox-LDL刺激后TRB3 mRNA表達的變化;
　　 4.構建TRB3重組腺病毒和TRB3siRNA，轉染巨噬細胞后，觀察TRB3過表達或抑制表達后CHOP mRNA

8、表達的變化。
　　 結論：
　　 1.ox-LDL呈劑量和時間依賴性促進巨噬細胞CHOP、ATF4 mRNA表達;
　　 2.ox-LDL可誘導巨噬細胞發(fā)生ER stress;
　　 3.巨噬細胞發(fā)生ER stress時以CHOP、ATF4的表達增加為主;
　　 4.ER stress促進巨噬細胞TRB3 mRNA的合成;
　　 5.CHOP可促進ox-LDL誘導的TRB3表達，TRB3負