櫛孔扇貝(Chlamys farreri)高密度圖譜構(gòu)建和基因組框架圖譜繪制.pdf

1、櫛孔扇貝Chlamys farreri(Jones et Preston1904)作為雙殼類的一種,是我國極具商業(yè)價(jià)值的重要經(jīng)濟(jì)種。本研究借助二代測序平臺(tái),建立了櫛孔扇貝高通量SNP開發(fā)與分型技術(shù),構(gòu)建了高精度圖譜,進(jìn)行了經(jīng)濟(jì)性狀的精細(xì)定位,繪制了基因組框架圖譜,并實(shí)現(xiàn)了遺傳圖譜與序列圖譜的整合,為扇貝基因組學(xué)研究提供了較為全面的序列信息和整合的資源工具,也為雙殼貝類生長繁殖機(jī)制、進(jìn)化適應(yīng)性機(jī)制和基因組輔助育種研究提供了新的起點(diǎn)。

2、>　　1、櫛孔扇貝高通量SNP開發(fā)與分型技術(shù)的建立
　　本研究首先對(duì)2b-RAD技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化,包括限制性內(nèi)切酶選擇、選擇性堿基確定和barcode設(shè)計(jì)三方面,建立了高通量SNP開發(fā)技術(shù)。本研究還開發(fā)了適合無參照基因組的非模式生物作圖群體的SNP分型策略,將共顯性和顯性標(biāo)記的分型算法整合成流程化軟件RADtyping,并對(duì)其分型結(jié)果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。擬南芥擬測交F1群體模擬數(shù)據(jù)的分型結(jié)果評(píng)價(jià)顯示:當(dāng)親本測序深度均超過10 x,高于

3、98％的位點(diǎn)源于基因組單拷貝區(qū),說明RADtyping可有效過濾重復(fù)序列。當(dāng)親本和子代測序平均深度均達(dá)20 x,共顯性標(biāo)記分型準(zhǔn)確性達(dá)97%;顯性標(biāo)記分型準(zhǔn)確性則在較低測序深度下就可達(dá)98%。對(duì)作圖群體而言,當(dāng)每個(gè)親本和子代的平均測序深度均至少20 x則可滿足分型準(zhǔn)確性的要求。通過比較兩套重復(fù)測序文庫分型結(jié)果發(fā)現(xiàn),共顯性標(biāo)記一致性達(dá)96%,顯性標(biāo)記分型一致性達(dá)99%。對(duì)RADtyping分型得到的8個(gè)共顯性和8個(gè)顯性標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行Sang

4、er測序的結(jié)果顯示共顯性標(biāo)記驗(yàn)證率達(dá)96%,顯性標(biāo)記驗(yàn)證率達(dá)97%,驗(yàn)證了RADtyping在無參照基因組SNP分型的準(zhǔn)確性。
　　2、櫛孔扇貝高精度圖譜構(gòu)建和重要經(jīng)濟(jì)性狀的QTL定位
　　本研究構(gòu)建了櫛孔扇貝首張高密度遺傳連鎖圖譜。整合圖譜包含3,806個(gè)SNP,分布于19個(gè)連鎖群,圖譜總長1543.4cM,標(biāo)記平均間隔為0.41cM,基因組覆蓋率達(dá)99.5%,623個(gè)SNP注釋到功能基因,平均重組率為1.3 cM/Mb。

5、生長性狀的QTL定位顯示:于1號(hào)和3號(hào)連鎖群分別檢測到一個(gè)顯著的QTL區(qū)間,各解釋表型變異的11.4%和16.9%。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果與QTL定位有較為一致的趨勢,驗(yàn)證了QTL定位的可靠性。3號(hào)連鎖群 QTL區(qū)間內(nèi)的 f68558標(biāo)記位于轉(zhuǎn)錄因子 PROP1(Homeobox protein prophet of Pit-1)的內(nèi)含子中,已知PROP1具有調(diào)控生長激素分泌的作用,在動(dòng)物中生長激素可調(diào)控生長、細(xì)胞分裂和再生,推測 PROP1基因

6、可能是控制櫛孔扇貝體尺性狀的主效基因。性別相關(guān)的QTL被定位于11號(hào)連鎖群的0.37 cM的區(qū)間,關(guān)聯(lián)分析鑒別到27個(gè)顯著與性別相關(guān)的標(biāo)記(P<1E-6)且位于 QTL定位的區(qū)間中。標(biāo)記 f93422位于轉(zhuǎn)錄因子 ZNFX1( NFX1-typezinc finger-containing1)中,已有研究表明河豚中 ZNFX1與性別決定基因 AMHR2(anti-Mullerian hormone receptor type II)緊密

7、連鎖。本研究為解析扇貝生長和繁殖調(diào)控機(jī)制提供了候選位點(diǎn)。
　　3、櫛孔扇貝全基因組序列圖譜繪制及與遺傳圖譜的整合
　　本研究根據(jù)扇貝基因組高度雜合高重復(fù)序列含量的特點(diǎn),選用家系來源的一只貝為材料,搭配構(gòu)建不同長度 DNA插入片段文庫進(jìn)行測序,獲得櫛孔扇貝的基因組測序數(shù)據(jù)。組裝采用先將兩套雜合contigs分出后,單倍體基因組單獨(dú)拼裝再整合的策略進(jìn)行櫛孔扇貝全基因組框架圖譜的繪制。拼接共獲得143,162條 scaffolds

8、, scaffold N50為528.6Kb,總長度約805Mb;Contigs共192,003條,contig N50達(dá)到21.5Kb,總長為777Mb。基因組scaffolds覆蓋了93%的轉(zhuǎn)錄組序列,基因預(yù)測獲得20,573個(gè)基因,其中62.7%的基因獲得功能注釋,基于同源比對(duì)和從頭預(yù)測獲得的重復(fù)序列占基因組序列的12.7%。借助遺傳圖譜,與基因組框架圖譜和物理圖譜進(jìn)行了整合。從染色體水平,排序了2,923條 scaffolds。