毒蕈堿膽堿受體3在小細胞肺癌中的表達及意義.pdf

1、肺癌是一種最常見的惡性腫瘤，其中，小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)占原發(fā)肺癌的15％～25％，其倍增時間短、生長快，很早就發(fā)生全身轉(zhuǎn)移。90％的SCLC患者首選放療和化療。雖然對放、化療敏感，但SCLC是近30年來所有治療敏感的腫瘤中最容易復(fù)發(fā)、預(yù)后最差的一種。有鑒于此，在放、化療的基礎(chǔ)上，尋找更有效的藥物作為一種輔助治療手段對SCLC的治療有重要意義。
　　 近年來，非神經(jīng)元性膽堿能信號通路

2、與腫瘤的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞能夠自分泌或旁分泌乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)，作用于自身或鄰近細胞上的煙堿型膽堿受體(nicotinic cholinergic receptors，NRs)和毒蕈堿型膽堿受體(muscarinic cholinergic receptors，MRs)，調(diào)節(jié)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等。MRs有5個亞型(M1R～M5R)，研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、前列腺癌等都有MRs的表達，而且

3、MRs拮抗劑能夠抑制腫瘤細胞增殖、血管發(fā)生、細胞遷移并增加凋亡等，其中尤以M3R為重要。但有關(guān)M3R和SCLC的研究報道不多，M3R在SCLC細胞增殖中作用的研究結(jié)果還不一致，M3R在SCLC其他方面如腫瘤細胞黏附、遷移及侵襲中的作用尚未見報道。
　　 M3R拮抗劑在臨床上治療慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonarydisease，COPD)已經(jīng)很長時間，具有很好的安全性和療效。如果在體外證實

4、了SCLC細胞株表達M3R且M3R拮抗劑能夠抑制SCLC細胞增殖、遷移、侵襲和黏附等，將為進一步研究M3R拮抗劑作為SCLC輔助治療的一種手段提供試驗和理論依據(jù)，也許能夠為SCLC尤其是同時合并COPD患者的治療帶來新的希望。基于上述考慮，我們做了如下的研究。
　　 第一章、體外人小細胞肺癌細胞株的培養(yǎng)
　　 目的：體外培養(yǎng)人SCLC細胞株SBC3和H82并觀察其生長特性，以備后續(xù)試驗所用。
　　 方法：體外培養(yǎng)

5、SBC3和H82細胞，采用cell counting kit-8試劑盒檢測細胞生長曲線，MycoAlert支原體檢測試劑盒監(jiān)測所培養(yǎng)細胞有無支原體污染。
　　 結(jié)果：SBC3和H82細胞傳代后經(jīng)過大概24h潛伏期，至48h及72h進入大量分裂的對數(shù)生長期。大概96h，細胞達到飽和密度后，生長緩慢并停止，進入平臺期，然后退化衰亡(圖2)。SBC3和H82細胞培養(yǎng)不同時間平均吸光度(opticaldensity，OD)值見表1。試驗

6、所用人SCLC細胞株SBC3和H82沒有支原體的污染。
　　 結(jié)論：SBC3和H82體外培養(yǎng)生長良好，此研究所培養(yǎng)的腫瘤細胞SBC3和H82細胞沒有被支原體污染，培養(yǎng)至48h及72h進入對數(shù)生長期，是行M3R受體檢測及功能試驗的最佳時間。
　　 第二章、毒蕈堿膽堿受體3在小細胞肺癌中的表達
　　 目的：明確SCLC細胞株SBC3和H82是否表達M3R，以進一步行M3R在SCLC中功能的研究。
　　 方法：

7、體外培養(yǎng)人SCLC細胞株SBC3和H82，采用RT-PCR及Western blotting法檢測細胞M3R mRNA及蛋白的表達。
　　 結(jié)果：如圖3、圖4所示，SBC3和H82細胞均有特異性M3RmRNA和蛋白的表達。SBC3細胞M3R mRNA的表達強于H82細胞，以β-actin標化后的SBC3細胞M3R蛋白表達強度為H82細胞的2.65倍(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：人SCLC細胞株SBC3和H82表達M3R

8、，M3R表達水平在兩細胞株間存在差異。SBC3細胞株M3R表達明顯強于H82，故選擇SBC3細胞株進一步研究M3R在SCLC中的功能。
　　 第三章、毒蕈堿膽堿受體3在小細胞肺癌中的功能研究
　　 第一節(jié) 毒蕈堿膽堿受體3在小細胞肺癌增殖中的作用
　　 目的：研究M3R在SCLC細胞增殖中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)人SCLC細胞株SBC3，采用MTT比色法研究膽堿受體激動劑碘化乙酰膽堿(acetych

9、oline iodide，Ach)及選擇性M3R拮抗劑4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine methiodide(4-DAMP)對細胞增殖的影響。試驗分組如下：①正常對照組；②不同濃度Ach組(10-6、10-5、10-4、10-3M)；③Ach(10-4M)+不同濃度4-DAMP組(10-8、10-7、10-6、10-5M)；④不同濃度4-DAMP組(10-8、10-7、10-6、10-5M)。分別

10、于0、24、48、72h通過檢測550 nm/650nm OD值判定各組中活細胞數(shù)量。
　　 結(jié)論:外源性Ach濃度依賴性地刺激SCLC增殖，M3R拮抗劑能夠阻斷Ach的作用。無外源性Ach的條件下，M3R拮抗劑亦能夠抑制SCLC的增殖。
　　 第二節(jié) 毒蕈堿膽堿受體3在小細胞肺癌遷移、侵襲中的作用
　　 目的:研究M3R對SCLC細胞遷移的影響及M3R在基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix me

11、talloproteinase，MMP-2和MMP-9)誘導(dǎo)的細胞侵襲中的作用。
　　 方法:體外培養(yǎng)人SCLC細胞株SBC3，采用Boyden侵襲小室法研究膽堿受體激動劑Ach及選擇性M3R拮抗劑4-DAMP對細胞遷移的作用。試驗分組如下：①不同濃度Ach組(10-7、10-6、10-5和10-4M)；②不同濃度4-DAMP(10-7、10-6、10-5M)+10-4M Ach組。顯微鏡下計數(shù)5個高倍視野(400×)細胞數(shù)求平

12、均值后記做遷移細胞數(shù)。采用明膠酶譜法分析測定不同濃度Ach(10-6、10-5、10-4M)對SBC3細胞MMP-2和MMP-9表達水平的影響，試驗分組如下：①VA13細胞培養(yǎng)液為陽性對照；②RPMI-1640尤血清培養(yǎng)液為陰性對照；③不同濃度Ach(10-6、10-5、10-4M)作用后的SBC3細胞培養(yǎng)液。
　　 結(jié)論:Ach刺激SCLC向Fn的遷移，M3R拮抗劑阻斷Ach的作用。各濃度Ach不影響SBC3細胞MMP-2和M

13、MP-9的表達，M3R在MMP-2和MMP-9誘導(dǎo)的SBC3細胞侵襲中可能沒有作用。
　　 第三節(jié) 毒蕈堿膽堿受體3在小細胞肺癌黏附中的作用
　　 目的:研究M3R在SCLC黏附中的作用及其影響機制。
　　 方法:體外培養(yǎng)人SCLC細胞株SBC3，采用流式細胞法檢測整合素的表達，相同方法觀察膽堿受體激動劑Ach和選擇性M3R拮抗劑4-DAMP對SBC3細胞所表達的整合素的影響。Ach、4-DAMP及整合素抗體對S

14、BC3細胞黏附的作用用人Fn包被的96孔板來研究。牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和Fn包被的孔中加入未經(jīng)藥物處理的細胞分別作為陰性和陽性對照，F(xiàn)n包被孔加入不同藥物處理的細胞的試驗分組如下：①10-4M Ach+10-5M4-DAMP；②10-4MAch+5μg/ml抗人αv整合素抗體；③10-4M Ach+5μg/ml抗人α5整合素抗體；④10-4M Ach+5μg/ml抗人αv和α5整合素抗體；⑤1

15、0-4M Ach+5μg/ml抗人β1整合素抗體；⑥10-4MAch。顯微鏡下計數(shù)5個高倍視野(200×)細胞數(shù)求平均值記做黏附細胞數(shù)。
　　 結(jié)論:M3R拮抗劑抑制體外SCLC的黏附，這種作用是通過抑制細胞表面含β1的整合素(αvβ1和α5β1)的功能實現(xiàn)的，而不能改變整合素的表達水平。
　　 本研究得到下列結(jié)論：
　　 1.人SCLC細胞株SBC3和H82均表達M3R，M3R可能為SCLC治療潛在的新的靶點。

16、
　　 2.外源性Ach濃度依賴性地刺激SCLC細胞增殖，M3R拮抗劑能夠阻斷Ach刺激的細胞增殖。
　　 3.在沒有外源性Ach的情況下，M3R拮抗劑亦可以阻斷SCLC細胞增殖，說明SCLC能夠自分泌內(nèi)源性Ach，Ach做為一種生長因子通過作用于M3R，刺激細胞的增殖。
　　 4.外源性Ach濃度依賴性地刺激SCLC細胞的遷移，M3R拮抗劑阻斷Ach的作用，說明在體外M3R拮抗劑能夠抑制SCLC的遷移。