青藤堿對佐劑關節(jié)炎大鼠HPA軸、外周血單個核細胞皮質酮受體及滑膜組織CRH、ACTH表達的影響.pdf

1、目的：類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一類以慢性、對稱性、多關節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，最終可影響關節(jié)功能甚至致殘。其侵犯的靶器官主要是關節(jié)滑膜。該病的病因尚不完全明確。近年來，神經(jīng)-內分泌-免疫網(wǎng)絡途徑在RA的發(fā)病機制中越來越受到重視。業(yè)已證實，該系統(tǒng)對RA發(fā)病的免疫調節(jié)主要是通過下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA軸)實現(xiàn)的。H

2、PA軸在抑制RA炎癥反應和免疫功能調節(jié)中具有重要作用。糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor,GCR)不僅是糖皮質激。素(glucocorticoid，GC)或皮質醇(大鼠體內為皮質酮)免疫信號的介導者，其本身也是機體免疫調節(jié)的有效工具。其與靶細胞結合量的變化可能與RA的發(fā)生、發(fā)展有一定的內在聯(lián)系。青藤堿(sinomenine)可能是通過HPA軸，增強腎上腺皮質激素的分泌，起到非特異性抗炎作用。然而，對于青藤堿通

3、過HPA軸治療RA的臨床和實驗室研究目前開展的很少。本課題以佐劑關節(jié)炎(adjuvant-induccd arthritis，AA)大鼠模型為基礎，觀察研究青藤堿對其關節(jié)炎癥程度，血漿促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin release hormone，CRH)、促腎上腺皮質激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)和皮質。酮，滑膜組織CRH、ACTH表達以及外周血單個核細胞GCR表達的影

4、響，探討HPA軸在RA發(fā)病機制中的作用以及青藤堿的治療效果。方法：(1)將125只雄性Wistar大鼠隨機分為5組，每組25只。I組：正常對照組，II組：單純造模組，III組：造模+低劑量青藤堿治療組，Ⅳ組：造模+中劑量青藤堿治療組，V組：造模+高劑量青藤堿治療組。第II～V組每只大鼠多點皮內注射完全性弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)制作AA大鼠模型。造模成功率依據(jù)關節(jié)炎指數(shù)(arthritisi

5、ndex，AI)評定。各組又根據(jù)造模后不同時間點(7、14、28、35及42天)各分為5個亞組。(2)造模后第14天開始，Ⅲ組、Ⅳ組和V組分別給予青藤堿注射液15mg/kg·d，30mg/kg·d，60mg/kg·d肌肉注射治療。(3)測定不同時間點各組大鼠的踝關節(jié)下足墊厚度，并進行AI評分。(4)應用放射免疫分析法檢測不同時間點各組大鼠血漿CRH、ACTH及皮質酮濃度。(5)應用放射配體結合分析法檢測外周血單個核細胞GCR表達情況。(

6、6)對不同時間點各組大鼠滑膜組織進行CRH、ACTH的免疫組織化學染色，采用真彩病理圖象分析系統(tǒng)進行定量分析。(7)觀察不同時間點各組大鼠踝關節(jié)病理改變，并進行病理積分評定。(8)應用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。 結果：(1)AI：第II組大鼠造模后各時間點AI均高于第I組(P＜0.01)，高峰出現(xiàn)在造模后28天；35～42天Ⅳ組、V組AI低于II組(P＜0.05)，III組與II組之間AI無統(tǒng)計學差異(P＞0.0

7、5)；III組、Ⅳ組、V組之間各時間點AI值無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。(2)踝關節(jié)下足墊厚度：第II～V組大鼠足墊厚度均于造模后14天開始增厚，21～28天達峰值，之后逐漸下降，42天足墊厚度仍高于正常對照組值(P＜0.01)；V組于28天足墊厚度低于II組(P＜0.05)，較Ⅳ組提前14天，即Ⅳ組第42天足墊厚度低于II組(P＜0.01)，III組各時間點足墊厚度與II組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；V組于28天足墊厚度低于I

8、II組(P＜0.05)，較Ⅳ組提前7天，V組于35天足墊厚度低于Ⅳ組(P＜0.05)。(3)血漿CRH濃度：與I組比較，II～V組在造模后35天血漿CRH濃度水平顯著下降(P＜0.01)，至造模后42天雖III～V組有所上升(P＜0.05)，但II～V組仍低于正常對照組值(P＜0.05)；與II組比較，Ⅳ～V組血漿CRH濃度在35天以后明顯升高(P＜0.05)，III組在42天時高于II組(P＜0.01)，提示中劑量和高劑量在35天時顯

9、示出治療效果，可提高AA大鼠血漿CRH水平，較低劑量提前7天；35～42天時，IV組血漿.CRH濃度高于III組，V組高于IV組且均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，提示高劑量治療效果優(yōu)于中劑量，而中劑量又優(yōu)于低劑量。(4)血漿ACTH濃度：與I組比較，II～V組在造模后14天血漿ACTH濃度水平顯著上升(P＜0.01)，28天達到高峰，后雖III～V組有所下降(P＜0.05)，但至造模后42天II～V組仍高于正常對照組值(P＜0.01)

10、；與II組比較，V組血漿ACTH濃度在35天以后降低(P＜0.05)，Ⅳ組在42天低于II組(P＜0.01)，提示高劑量組在35天時顯示出治療效果，可降低AA大鼠血漿ACTH水平，較中劑量組提前7天，低劑量組在觀察時間內未顯示出治療效果；35天時，V組血漿ACTH濃度低于III組(P＜0.05)，42天時，Ⅳ組血漿ACTH濃度低于III組，V組低于Ⅳ組(P＜0.05)，提示高劑量組起效最早，且治療效果最佳。(5)血漿皮質酮濃度：與I組比

11、較，II～V組在造模后14天血漿皮質酮濃度水平顯著下降(P＜0.01)，28天降至最低，后雖Ⅳ～V組血漿皮質酮濃度有所上升(P＜0.05)，但至造模后42天Ⅱ～Ⅴ組血漿皮質酮水平仍低于正常對照組值(P＜0.01)；與Ⅱ組比較，Ⅳ～Ⅴ組皮質酮濃度在35天以后高于Ⅱ組(P＜0.05)，而Ⅲ組在各時間點血漿皮質酮濃度與Ⅱ組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。提示中、高劑量組在35天時顯示出治療效果，可提高AA大鼠血漿皮質酮水平，而低劑量組在觀察

12、時間內未顯示出治療效果；35天時，Ⅴ組血漿皮質酮濃度高于Ⅲ組、Ⅳ組(P＜0.05)，Ⅲ組與Ⅳ組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，42天時，Ⅳ組血漿皮質酮濃度高于Ⅲ組(P＜0.05)，Ⅴ組高于Ⅳ組(P＜0.01)，以上提示高劑量組治療效果優(yōu)于中劑量組。(6)外周血單個核細胞GCR表達：與正常對照組比較，AA模型組外周血單個核細胞GCR表達下降(P＜0.01)，經(jīng)高劑量青藤堿治療28天后GCR表達較模型組上升(P＜0.05)，但仍低于正常水

13、平(P＜0.05)，提示青藤堿能夠提高AA大鼠外周血單個核細胞GCR表達。(7)滑膜組織CRH、ACTH表達：與Ⅰ組比較，Ⅱ～Ⅴ組滑膜組織CRH、ACTH的表達量在各個時間點均明顯升高(P＜0.01)，Ⅱ組表達最強，峰值出現(xiàn)于造模后28天，后逐漸下降；與Ⅱ組比較，3個治療組都能夠降低AA大鼠滑膜組織CRH、ACTH的表達量(P＜0.01)，其中高劑量青藤堿在造模后28天就顯示出此作用，中劑量于造模后35天起效，低劑量起效最晚，為造模后4

14、2天；28天時Ⅴ組滑膜組織CRH、ACTH表達低于Ⅲ組和Ⅳ組(P＜0.01)，35～42天時，Ⅴ組低于Ⅳ組、Ⅳ組低于Ⅲ組(P＜0.01)，提示高劑量治療效果優(yōu)于中劑量，而中劑量又優(yōu)于低劑量。(8)踝關節(jié)病理積分：造模后各個時間點，Ⅱ組病理積分均顯著高于Ⅰ組(P＜0.01)，其中28～42天最高；3種劑量的青藤堿均能降低病理積分，其中高劑量作用最強，35～42天V組病理積分較III組、Ⅳ組低(P＜0.05)。(9)相關性分析：踝關節(jié)下足墊

15、厚度分別與AI、血漿ACTH濃度、滑膜組織CRH、ACTI：{表達量之間呈正相關，P＜0.01；而與血漿CRH、皮質酮濃度之間分別呈負相關，P＜0.01；血漿ACTH濃度分別與滑膜組織CRH、ACTH表達量之間呈正相關，P＜0.01；滑膜組織CRH與ACTH表達量之間呈正相關，P＜0.0 1。結論：(1)AI與踝關節(jié)下足墊厚度呈正相關，均能反映關節(jié)腫脹情況，后者更為精確、客觀。(2)造模后AA大鼠血漿CRH降低，ACTH升高，皮質酮濃度

16、降低，提示HPA軸存在功能缺陷，而且可能同時發(fā)生在下丘腦和腎上腺水平。經(jīng)青藤堿治療后各項指標有所恢復，但不能至正常水平。青藤堿治療效果與劑量、時間相關。劑量越大，時間越長，治療效果越好。(3)造模后AA大鼠外周血單個核細胞GCR表達降低，經(jīng)高劑量青藤堿治療后有所恢復，但不能至正常水平。提示AA發(fā)病過程中GCR表達降低，且青藤堿具有一定的治療作用。(4)造模后從大鼠滑膜組織CRH、ACTH表達顯著高于正常對照組，經(jīng)青藤堿注射液治療后有所恢