白藜蘆醇對(duì)宮頸癌侵襲的影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、一.目的
　　 宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在全球婦女中,宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌居第二位,嚴(yán)重威脅廣大婦女的生命健康。據(jù)保守估計(jì),全球每年約新增加50萬(wàn)例臨床確診的宮頸癌病例,其中大部分發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)每年新增宮頸癌患者約13萬(wàn),每年約有5萬(wàn)人死于宮頸癌。近年來(lái)我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率明顯上升,且發(fā)病年齡逐漸年輕化,呈雙峰狀分布,即35-39歲和60-69歲[1]。宮頸癌的主要特點(diǎn)是局部蔓延,早期的侵襲轉(zhuǎn)移往往使患者錯(cuò)

2、過(guò)了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)。因此,尋找一種抗宮頸癌侵襲的藥物將成為成功治療宮頸癌的關(guān)鍵。
　　 白藜蘆醇是一種多酚化合物,是植物在惡劣環(huán)境下或遭到病原體侵害時(shí)自身分泌的一種植物抗毒素[2]。研究表明[2],白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、雌激素樣、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能,在腫瘤的啟動(dòng)、發(fā)生和發(fā)展三個(gè)階段均發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用[3]。其主要活性表現(xiàn)為:1)抑制細(xì)胞色素酶:細(xì)胞色素P450能夠通過(guò)氧化作用使某些致癌物質(zhì)如BaP轉(zhuǎn)

3、變?yōu)楦叨戎峦蛔冄苌锊⑨尫抛杂苫?導(dǎo)致DNA氧化損傷。白藜蘆醇是細(xì)胞色素P450抑制劑,可阻止這一過(guò)程的發(fā)生[4];2)誘導(dǎo)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、尿嘧啶-雙磷酸葡萄糖酸基轉(zhuǎn)移酶等解毒酶活性,使致癌物解[5]；3)抑制環(huán)氧合酶(COX):白藜蘆醇可通過(guò)阻礙核轉(zhuǎn)錄因子NF-Kb的活化抑制COX表達(dá),從而抑制環(huán)氧合酶活性[6]；4)抑制蛋白激酶活性:酪氨酸蛋白激酶(PTK)能激活A(yù)TP末端磷酸,使底物蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基磷酸化,這一過(guò)程在腫瘤基

4、因表達(dá)的信息傳遞中起重要作用,許多惡性腫瘤細(xì)胞都發(fā)現(xiàn)有某種特定的PTK被激活或過(guò)量表達(dá)。白藜蘆醇可通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合機(jī)制抑制PKC的活性從而達(dá)到抗腫瘤的作用[7-8]。近年來(lái),白藜蘆醇在防治腫瘤方面顯示出巨大的潛力,其作用機(jī)制的研究逐漸得到關(guān)注。然而,目前的研究多集中于白藜蘆醇對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響,對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的影響及其作用機(jī)制知之甚少。關(guān)于白藜蘆醇對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究目前尚屬空白。開(kāi)發(fā)白藜蘆醇的抗宮頸癌作用,為宮頸癌的生物學(xué)

5、治療提供更多一種可供選擇的藥物,是一項(xiàng)有價(jià)值的工作。
　　 本研究將白藜蘆醇作用于體外培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞及HeLa細(xì)胞荷瘤鼠模型,觀察其對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲的影響,探討作用機(jī)制,摸索合理的用藥濃度,為白藜蘆醇在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 二.實(shí)驗(yàn)材料及方法
　　 第一部分:首先應(yīng)用不同濃度的白藜蘆醇作用于宮頸癌HeLa細(xì)胞,采用MTT法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,計(jì)算出藥物的半量抑制濃度(IC50)。根

6、據(jù)藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況聯(lián)合藥物的IC50值,我們將對(duì)細(xì)胞增殖影響較小的藥物濃度作為后續(xù)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移影響的實(shí)驗(yàn)藥物濃度。白藜蘆醇處理HeLa細(xì)胞24h后,transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的改變情況；逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、Western blot及酶譜法分別檢測(cè)與腫瘤細(xì)胞侵襲密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、-9,基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制

7、劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)-1、-2 mRNA、蚩自及酶表達(dá)活性的改變情況,計(jì)算MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-2值,探討基質(zhì)金屬蛋白酶與其組織抑制劑之間的平衡與宮頸癌侵襲之間的關(guān)系；掃描電鏡觀察白藜蘆醇對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞板狀偽足的影響,逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及Westernblot檢測(cè)誘導(dǎo)板狀偽足產(chǎn)生的表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growt

8、h Factor,EGF)基因及蛋白表達(dá)水平;同時(shí)采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及Western blot檢測(cè)維持腫瘤細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài)的鉀氯共轉(zhuǎn)運(yùn)載體(K-Cl cotransport carrier,KCC)的基因及蛋白表達(dá)水平,為白藜蘆醇在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第二部分:應(yīng)用雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn),研究白藜蘆醇對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferators-act

9、ivated receptor,PPARγ)活性的影響。逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及Western blot法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)宮頸癌細(xì)胞PPARγ表達(dá)水平的影響。進(jìn)一步應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及Westernblot法檢測(cè)應(yīng)用PPARγ拮抗劑預(yù)處理后的宮頸癌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子及活化子3(Signal transducer and activator of transcription,STATs)、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(Ec

10、to-matrix metalloproteinases inducing factor,EMMPRIN)及MMP基因及蛋白的表達(dá)水平,探討PPARγ依賴(lài)的JAK-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在白藜蘆醇抑制MMP表達(dá)及活性中的作用。
　　 第三部分:構(gòu)建宮頸癌HeLa細(xì)胞荷瘤鼠模型,采用腹腔給藥的方法每日注射不同濃度的白藜蘆醇。觀察荷瘤鼠的一般狀態(tài)及腫瘤的生長(zhǎng)情況。逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)及Western blot法分別檢測(cè)瘤組織

11、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)的改變情況。免疫組化方法檢測(cè)瘤組織微血管形成情況,了解白藜蘆醇在體內(nèi)對(duì)宮頸癌的影響。同時(shí)留取荷瘤鼠眼眶靜脈血,應(yīng)用ELISA方法進(jìn)行肝腎功能檢測(cè),評(píng)價(jià)白藜蘆醇在體內(nèi)的藥物毒性。
　　 三.結(jié)果
　　 第一部分:MTT法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況,結(jié)果表明,白藜蘆醇的半量抑制濃度(IC50)為0.8638mmol/L。濃度為0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol

12、/L的白藜蘆醇對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為27.78％、45.89％、55.13％。聯(lián)合分析細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況及藥物的IC50值,我們將后續(xù)檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲影響的實(shí)驗(yàn)藥物濃度確定為0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L。采用上述三個(gè)濃度的白藜蘆醇處理細(xì)胞24h后,檢測(cè)HeLa細(xì)胞侵襲能力,結(jié)果表明,白藜蘆醇能夠以劑量依賴(lài)的方式抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲。進(jìn)一步對(duì)白藜蘆醇抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的作

13、用機(jī)制進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)隨著白藜蘆醇劑量的增加,腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移所必備的細(xì)胞裝配--細(xì)胞板狀偽足的質(zhì)量明顯降低,誘導(dǎo)板狀偽足生成的EGF基因及蛋白的表達(dá)水平亦明顯減少；研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇能夠以劑量依賴(lài)的方式抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞MMP-2、MMP-9基因、蛋白的表達(dá)水平及酶活性,提高TIMP-1、TIMP-2基因、蛋白的表達(dá)水平及酶活性,降低MMP/TIMP值,恢復(fù)兩者之間的平衡關(guān)系；與此同時(shí),白藜蘆醇能夠抑制腫瘤細(xì)胞KCC-1 mRN

14、A及蛋白的表達(dá)水平,破壞腫瘤細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài)的維持,降低宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　 第二部分:研究表明,白藜蘆醇能夠以劑量依賴(lài)的方式提高PPARγ的活性及表達(dá)水平。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)STAT3基因及蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響,但能夠以劑量依賴(lài)的方式抑制STAT3蛋白磷酸化,同時(shí)抑制EMMPRIN和MMP基因及蛋白的表達(dá)水平。應(yīng)用RT-PCR及Western blot法檢測(cè)PPARγ拮抗劑(GW9662)預(yù)處理后的宮頸癌細(xì)胞STAT3、

15、EMMPRIN及MMP基因及蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果表明抑制PPARγ活性后,白藜蘆醇對(duì)HeLa細(xì)胞STAT3蛋白磷酸化及EMMPRIN、MMP基因及蛋白表達(dá)的抑制作用消失。
　　 第三部分:成功構(gòu)建宮頸癌HeLa細(xì)胞荷瘤鼠模型,采用腹腔給藥的方法每日注射不同濃度的白藜蘆醇。結(jié)果表明,白藜蘆醇能夠以劑量依賴(lài)的方式抑制荷瘤鼠模型腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)果同時(shí)表明,隨著白藜蘆醇劑量的增加MMP-2、MMP-9mRNA及蛋白表達(dá)水平降低,瘤組織微血管

16、的形成明顯減少。與此同時(shí),白藜蘆醇對(duì)機(jī)體的肝腎功能沒(méi)有明顯的影響。
　　 四.結(jié)論
　　 第一部分:(1)白藜蘆醇能夠以劑量依賴(lài)的方式抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲能力；(2)白藜蘆醇能夠明顯抑制宮頸癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)及活性,提高TIMP-1、TIMP-2表達(dá)及活性,降低MMP/TIMP值,恢復(fù)兩者之間的平衡關(guān)系,降低MMP對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力；(4)白藜蘆醇能夠抑制由EGF誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞板狀偽足的形成；

17、(5)白藜蘆醇作用后,維持細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài)的KCC1基因及蛋白的表達(dá)水平明顯下降,有效抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　 第二部分:(1)白藜蘆醇能夠明顯提高宮頸癌HeLa細(xì)胞PPARγ的表達(dá)及活性；(2)白藜蘆醇能夠通過(guò)PPARγ依賴(lài)的JAK-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表達(dá)及活性。
　　 第三部分:(1)白藜蘆醇能夠在體內(nèi)明顯抑制宮頸腫瘤的生長(zhǎng)；(2)在體內(nèi)白藜蘆醇能夠明顯